重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用与流程

本发明属于猪细小病毒技术领域，尤其涉及一种重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

猪细小病毒(porcineparvovirus，ppv)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体，母猪孕前期受ppv感染、经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起初产母猪不孕、流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻，给养猪业造成了极大的经济损失。近年来，ppv感染呈现扩大、上升的趋势，在全国范围内流行，遍及二十多个省、市，血清学调查阳性率普遍高达50％-80％，ppv俨然已成为猪重要的传染病之一，极大制约了我国养猪业的健康发展。

众所周知，畜禽重大疫病的防控关键都在于疫苗免疫，同样免疫接种是防控ppv的主要手段。目前，我国市场上已有包括哈兽研、上海农科院、武汉科前等多家单位研制的灭活疫苗上市，这些疫苗在一定程度上控制了我国ppv的流行，但其存在免疫持续时间短，抗体水平较低，免疫副作用大等缺陷，造成免疫效果常不尽人意。弱毒苗和dna疫苗因其安全性和技术瓶颈难以突破等原因还处于研发阶段。因此，克服目前ppv活苗、灭活苗以及基因工程疫苗缺点，寻找新的技术策略，研发一种安全、高效非复制的病毒疫苗是有效免疫防控ppv的重要科学前提。

病毒样粒子(virus-likeparticles，vlps)，是由病毒主要衣壳蛋白或包膜蛋白自主包装形成的空衣壳结构，在形态、结构及表面抗原和多肽表位与天然病毒粒子非常相似，作为免疫原，vlps模仿了病毒粒子的真实结构，比其它类型的亚单位疫苗更容易被免疫系统识别，并且以更真实的构象被抗原递呈细胞吞噬、加工和递呈；而且vlps结构与原病毒相似，就意味着与其它亚单位疫苗相比，低剂量就可以有效刺激产生和全病毒一样的保护反应。此外，因vlps不会产生任何可能导致感染的遗传成分，具有安全性好等特点，因此，病毒样粒子已经成为多种研究病毒疫苗的首选对象，成为今后病毒类疫苗研究的发展方向。目前，多种病毒样粒子疫苗已进入临床前期试验，其中由杆状病毒表达系统产生的乙型肝炎病毒vlps和人乳头瘤病毒vlps在美国已被批准上市。此外还有戊型肝炎vlps疫苗等多个品种在临床研究中，显示出该类疫苗的巨大潜力。研究证实，vp2蛋白是ppv的主要衣壳蛋白和主要的抗原表位聚集区，可自我组装形成病毒样颗粒，在病毒感染细胞过程中参与病毒dna的包装形成具有感染性的病毒粒子。tat蛋白转导域具有强大的蛋白转导功能，能把与之融合的蛋白、dna等物质跨膜转运到细胞内，并在细胞间传递，同时保留所携带外源物质的生物活性。近年来，应用蛋白转导域来增强动物疫苗免疫效果的报道屡见不鲜，蛋白转导域促进所携带蛋白的细胞提呈作用已证实。因此，tat蛋白转导域在动物疫苗领域有着广泛的研究和应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：tat-vp2融合基因，该基因由融合ppvvp2蛋白基因和2段tat蛋白转导域核苷酸序列形成且具有序列表seq.id.no.1的碱基序列。

上述tat-vp2融合基因在制备预防猪细小病毒病(ppvd)疫苗中的应用。

重组猪细小病毒样粒子，该病毒样粒子由融合ppvvp2蛋白基因和2段tat蛋白转导域核苷酸序列形成的tat-vp2融合基因所编码，且病毒样粒子具有序列表seq.id.no.2的氨基酸序列。

重组猪细小病毒样粒子的制备方法，将tat蛋白转导域通过两轮pcr扩增与形成ppv空衣壳蛋白所需的抗原vp2基因融合，克隆到杆状病毒转移载体获得同源重组载体，包装产生含有ppvvp2蛋白和tat蛋白转导域的重组杆状病毒，感染昆虫细胞，表达融合了ppvvp2蛋白和tat蛋白转导域的重组tat-vp2蛋白，形成病毒样粒子(vlps)。

上述重组猪细小病毒样粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)以猪细小病毒基因组dna为模板扩增出ppvvp2基因，人工合成tat蛋白转导域序列；

(2)通过两轮pcr扩增将步骤(1)获得的形成ppv空衣壳蛋白所需的抗原vp2基因与2段tat拼接形成tat-vp2融合基因，并通过bamhi/noti双酶切位点将其定向克隆至杆状病毒转移载体pfastbac1中构建重组杆状病毒转移载体pfast-tat-vp2；

(3)将步骤(2)获得的重组杆状病毒转移载体pfast-tat-vp2转化dh10bac感受态细胞进行同源重组，并筛选鉴定获得携带有目的基因tat-vp2的重组杆粒dna；

(4)将步骤(3)获得的重组杆粒dna以脂质体法转染对数生长期的sf9细胞，产生表达融合基因tat-vp2的重组杆状病毒株；

(5)将步骤(4)获得的重组杆状病毒株感染对数生长期的sf9细胞，表达tat-vp2融合蛋白；

(6)经反复冻融收集步骤(5)中获得的感染细胞培养液并裂解感染有tat-vp2基因重组杆状病毒的宿主细胞，纯化获得有生物活性的、自行组装形成的重组猪细小病毒样粒子(tat-vp2vlps)。

疫苗含有isa206佐剂。

上述重组猪细小病毒样粒子在制备预防猪细小病毒病(ppvd)疫苗中的应用。

针对目前缺乏安全高效防控猪细小病毒病的疫苗(ppv疫苗)的问题，发明人首次提出了用杆状病毒表达系统表达猪细小病毒vp2与tat融合基因，设计并制备了一种重组猪细小病毒样粒子，包括利用bac-to-bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达n端融合具有细胞穿膜功能的tat蛋白转导域的ppv重组vp2蛋白，体外组装形成重组病毒样粒子。具体操作是先扩增ppvvp2全基因序列，再利用pcr方法在vp2的n端引入tat蛋白转导域，构建包含融合基因tat-vp2的重组杆状病毒，重组杆状病毒感染sf9细胞表达目的蛋白并获得重组猪细小病毒样粒子。研究表明，tat-vp22融合基因能在昆虫细胞中进行表达，表达的融合蛋白具有高度组装成病毒样粒子的能力；融合ppvvp2蛋白和tat蛋白转导域的重组杆状病毒能够有效表达出目的蛋白tat-vp2，并且表达的目的蛋白可形成病毒样粒子，形成的vlps可以辅以佐剂接种动物，可有效刺激ppv特异性抗体产生，提高淋巴细胞产生细胞因子能力，与单纯的vp2蛋白相比，具有增强免疫的效果。因此，应用本发明可研制具有良好免疫效果的新型高效ppv亚单位疫苗。

附图说明

图1是vp2基因pcr电泳图，图中：m：dl2000dnamarker，1、2：vp2pcr。

图2是克隆载体pmd-tat-vp2鉴定结果图，图中：m：dl15000dnamarker，1、2：pmd-tat-vp2双酶切产物。

图3是重组转移载体pfastbactat-vp2鉴定结果图，图中：m：dl5000dnamarker，1：pfastbacvp2pcr产物，2：pfastbacvp2双酶切产物，3：pfastbactat-vp2pcr产物，4：pfastbactat-vp2双酶切产物。

图4是重组杆粒bac-tat-vp2pcr鉴定结果图，图中：m：1kbdnaladder，1：bac-tat-vp2pcr产物，2：bac-vp2pcr产物。

图5是转染重组杆粒细胞病变图，图中：a：正常培养sf9细胞，b：bac-vp2转染病变细胞，c：bac-tat-vp2转染病变细胞。

图6是间接免疫荧光检测图，图中：a1：正常sf9细胞常光，a2：正常sf9细胞荧光，b1：bac-vp2感染细胞常光，b2：bac-vp2感染细胞荧光，c1：bac-tat-vp2感染细胞常光，c2：bac-tat-vp2感染细胞荧光。

图7是病毒粒子电镜观察图，图中：病毒粒子电镜观察(a：vp2蛋白形成病毒样粒子b：tat-vp2蛋白形成病毒样粒子)。

图8是ppv抗体消长情况。

具体实施方式

一、融合基因tat-vp2的构建

1.引物设计合成

根据genbank公布的ppvvp2序列设计扩增vp2基因特异性引物，人工合成tat蛋白转导域序列(表1)，引物由北京博迈德生物公司合成。其中引物p1、p4用于从病毒基因组上扩增vp2基因；p2、p4用于扩增在vp2n端引入第1段tat序列的tat-vp2基因，p3、p4用于扩增在vp2n端引入第2段tat序列的tat-vp2基因，p2、p3单下划线部分为tat序列，p3、p4双下划线部分引入的酶切位点。

表1目的基因tat-vp2扩增引物及tat蛋白转导域序列

2.tat-vp2基因的构建

2.1vp2基因的克隆

2.1.1pcr扩增vp2基因

以常规方法提取的ppv病毒基因组dna为模板，应用fastpfudnapolymerase聚合酶，用引物p1、p4扩增ppvvp2基因(图1)，扩增体系为：dna模板20ng，上游引物(20μm)0.5μl，下游引物(20μm)0.5μl，dntps(2.5mm)3μl，5xfastbuffer5μl，dnapolymerase1μl，去离子水补足25μl。扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性20s，65℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸7min。

2.1.2pcr扩增产物克隆、测序分析

pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用dna快速回收纯化试剂盒(北京天根)回收纯化pcr产物，将回收产物与pmd-18t克隆载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单个菌落培养，提取质粒，通过pcr、酶切鉴定为阳性克隆送生物公司进行进一步测序鉴定，证实成功克隆获得长1740bp目vp2基因(seq.id.no.9)。

2.2目的基因tat-vp2的扩增

以含vp2基因的质粒pmd-tat-vp2为模板，应用fastpfudnapolymerase聚合酶，用p2、p4引物进行第一轮pcr扩增，在vp2的n端引入1段tat序列。扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，68℃退火和延伸1min，32个循环；72℃延伸7min。回收纯化第一轮pcr扩增产物为模板，用p3、p4引物以与第一轮相同的扩增条件进行第二轮pcr扩增，扩增产物经回收纯化后与pmd-18t克隆载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，提取质粒，通过pcr、酶切鉴定为阳性克隆送生物公司进行进一步测序鉴定，证实成功获得长1812bp的tat-vp2基因(图2)。

二、重组杆状病毒的构建

1.重组转移质粒的构建与鉴定

pmd-tat-vp2质粒和pfastbac载体分别进行bamhi/noti双酶切，回收纯化目的片段tat-vp2及pfastbaci线性化片段，将回收的目的片段与pfastbaci线性化片段进行t4连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，提取质粒，通过pcr、酶切鉴定成功构建重组转移载体pfastbactat-vp2(图3)。

2.重组bacmid的构建与鉴定

2.1重组杆粒bac-2vp2-vp22构建

将重组质粒pfasttat-vp2转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，在辅助质粒的作用下pfasttat-vp2与杆状病毒骨架载体发生同源重组，获得包含tat-vp2基因的重组杆粒bac-2vp2-vp22，最终将外源基因tat-vp2插入到杆状病毒骨架载体中。

2.2重组细菌的挑选和质粒提取

将转入pfasttat-vp2重组质粒的dh10bac感受态细胞以100倍稀释，取50μl涂布于新鲜的含四环素(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、β-半乳糖苷(100μg/ml)和iptg(40μg/ml)的sob平板中，培养72小时后，挑取大的白色菌落重新接种于新的sob平板中，37℃培养过夜，挑取白色单克隆接种于含(50μg/ml)卡那霉素，(7μg/ml)庆大霉素，(10μg/ml)四环素的lb培养液中，37℃培养8-12h。提取重组杆粒bac-tat-vp2。

2.3重组杆粒bac-tat-vp2的鉴定

以提取的重杆粒bac-tat-vp2为模板，参考bac-to-bac表达系统说明书，以m13f)：5’-gttttcccagtcacgac-3’(seq.id.no.7)、m13r：5’-caggaaacagctatgac-3’(seq.id.no.8)为引物进行重组杆粒的pcr鉴定，获得长约4.1kb目的条带，pcr鉴定结果证实重组杆粒bac-tat-vp2构建成功(图4)。

3.重组杆状病毒的制备

3.1重组杆粒转染昆虫细胞

sf9细胞铺板于6孔板中培养，待细胞汇合度至70-80％时，用3000进行质粒转染。具体步骤如下：

(1)将2μg重组杆粒bac-tat-vp2和2μlp3000加入到250μl不含血清和抗生素的grace培养基中，轻轻混匀；

(2)将4μl3000脂质体加入到250μl不含血清和抗生素的grace培养基中，轻轻混匀；

(3)将步骤(2)和步骤(1)液体混合均匀，室温放置2～10min；

(4)将步骤(3)混合液逐滴滴入细胞中，置于27℃恒温培养。

3.2重组杆状病毒的收获及扩增

转染后每天观察细胞病变情况，细胞出现明显的病变，细胞变大，变圆或不规则，开始上漂(图5)，收集细胞及上清，提取细胞rna及培养上清中的重组杆状病毒，进行pcr鉴定，检测到目的基因的存在；转染后5天细胞出现明显病变，反复冻融收集细胞及其培养物上清，4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，此为p1代重组杆状病毒细胞毒。将p1代毒按照1∶10接种sf9细胞，27℃培养4-5天，细胞出现大量病变时收获p2代重组杆状病毒细胞毒，按同样方法培养p3代重组杆状病毒细胞毒，收集的重组病毒-70℃保存。

3.3重组杆状病毒的滴度测定

以p1、p2、p3代毒为原液，分别进行10倍倍比稀释，接种96孔板细胞，每个稀释度接种8孔，置于27℃恒温培养箱培养，每天观察病变情况，直到对照细胞完全脱落，记录每稀释度的病变情况，按karber法计算重组杆状病毒滴度，经计算p1～p3代重组杆状病毒的滴度在10^-3.375tcid50/0.1ml～10^-4.875tcid50/0.1ml之间。

三、重组蛋白的表达

1.重组蛋白ifa鉴定

重组杆状病毒按10％接种量感染sf9细胞，设置非感染组对照。27℃培养48h～72h，待细胞出现病变后以80％预冷丙酮固定2h，pbst洗涤3次，5％脱脂奶粉(tbst)4℃封闭过夜，pbst洗涤3次，加入1∶2000稀释的ppv单克隆抗体，37℃避光孵育1h，pbst洗涤3次，加入1∶1000稀释的fitc荧光标记的羊抗鼠igg，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，荧光显微镜观察并记录结果，重组杆状病毒感染的细胞有明显的绿色荧光出现，而对照组观测不到荧光，证实融合基因tat-vp2能在昆虫细胞中表达(图6)。

2.重组蛋白电镜观察

p2代重组杆状病毒按10％接种量感染sf9细胞，27℃培养5d后，反复冻融收集细胞及培养物上清，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，进行电镜观察，结果显示检测到形态大小与ppv全病毒粒子相似的直径约20nm的重组病毒样粒子，证实表明融合tat蛋白转导域的vp2蛋白能在体外有效形成病毒样粒子(图7)。

四、重组猪细小病毒样粒子疫苗制备及小鼠免疫试验

1.重组病毒样粒子疫苗制备

p2代重组杆状病毒按10％接种量感染sf9细胞，27℃培养5d后，反复冻融收集细胞上清及培养物，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，用饱和(nh4)2so4沉淀蛋白，tritonx-100和磷酸三丁酯(tbp)灭活杆状病毒，透析袋初步纯化蛋白，bca蛋白定量试剂盒测定浓缩50倍后蛋白浓度为6372.6μg/ml，调整重组蛋白浓度为500ng/μl，按照抗原/佐剂体积比例1∶1加入isa206佐剂完全乳化，制备成为重组猪细胞病毒样粒子疫苗。

2.小鼠免疫试验

选取24只8周龄的balb/c小鼠随机分3组，每组8只，其中第1组注射生理盐水为阴性对照，第2组注射vp2vlps疫苗，第3组注射tat-vp2vlps疫苗。经肌肉注射免疫小鼠，免疫200μl(含抗原50μg)，左右后肢肌肉各注射100μl，间隔两周后，以相同途径和剂量加强免疫一次。在首免后每间隔7天进行小鼠尾尖静脉采血，收集小鼠血清测定血清ppv抗体水平和细胞因子表达水平。

3.ppv特异性抗体检测

用ppvelisa检测试剂盒进行免疫小鼠ppv抗体检测，用羊抗鼠hrp-igg替代试剂盒中的酶标二抗进行抗体检测。取ppvelisa抗原包被板加入100μl1∶40倍稀释的待检血清，置37℃作用30min后弃去板孔中液体，加入300μl的洗液洗涤4次，每次3min，加入1∶25000稀释的羊抗鼠hrp-igg，100μl/孔，37℃反应30min后弃去板孔中液体，洗液洗涤4次，先后迅速加入50μl底物a和50μl底物b，轻轻震荡混匀，22℃-28℃避光显色10min，加入50μl终止液，在酶标仪上读取od650mm数值，结果显示，vp2vlps和tat-vp2vlps疫苗均能有效刺激小鼠产生特异性抗体，并且抗体消长规律基本一致，但产生的抗体水平无显著差异(图8)。

4.细胞因子检测

用小鼠白介素2(il-2)和γ干扰素(ifn-γ)elisa进行免疫小鼠细胞因子il-2和ifn-γ的检测。分别取il-2和ifn-γ抗原包被板依次加入配置好的不同浓度的100μl标准品、稀释好的血清，以稀释液作为零孔对照，37℃作用90min；弃去elisa板中的液体，加入100μl事先准备好的抗小鼠il-2或ifn-γ抗体工作液，稀释液孔不加，37℃作用60min；然后后弃去板孔中液体，加入300μl的洗液洗涤3次，每次2min；每孔加入90μltmb显色液，37℃避光放置25min；每孔加入100μl终止液，在酶标仪上读取od450mm数值，制作标准曲线，计算血清中il-2和ifn-γ含量。结果显示vp2vlps和tat-vp2vlps免疫小鼠后6周后，血清中il-2和ifn-γ的分泌水平明显升高，其中vp2vlps和tat-vp2vlps的il-2含量为976.4pg/ml和1159.1pg/ml，ifn-γ的含量为462.7pg/ml和603.4pg/ml，均显著高于生理盐水对照组，并且tat-vp2vlps免疫组的il-2和ifn-γ含量均要明显高于vp2vlps免疫组；提示vp2vlps和tat-vp2vlps作为免疫原均能有效诱导小鼠产生细胞免疫，并且tat-vp2vlps组诱导小鼠淋巴细胞产生细胞因子的能力要优于vp2vlps组。

本发明制备了含tat蛋白转导域的ppv重组vlps，并将其与isa206佐剂配制亚单位疫苗，通过免疫小鼠具有较好的免疫原性，若进一步优化接种条件、佐剂类型等，可以进一步进行猪体的免疫试验，具有更好的免疫保护效力，可用于ppv的预防。

sequencelisting

<110>广西壮族自治区兽医研究所

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<130>重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用

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