一种植物乳杆菌来源的苯丙酮酸还原酶及应用的制作方法

文档序号:11246259阅读:1611来源:国知局
一种植物乳杆菌来源的苯丙酮酸还原酶及应用的制造方法与工艺

本发明涉及一种植物乳杆菌来源的苯丙酮酸还原酶及应用,属于生物工程技术领域。



背景技术:

苯乳酸(phenyllacticacid,pla),又名2-羟基-3苯基丙酸,是一类非常重要的化合物,在医药及生物防腐剂等方面具有非常广泛的应用。苯乳酸具有与其衍生物丹参素(β-3,4一二羟基苯基乳酸钠)相同的药理功能,可以调节人体内的类固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成许多药物的重要中间物,比如:降血糖药恩格列酮(englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(statine)、抗艾滋病毒制剂、新型驱肠虫药pfl022a等。此外,近年来发现苯乳酸可作为新型的生物防腐剂,且具有非常广泛的抗菌谱,对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌)、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。而苯乳酸生物制备法因其具有高效性、高对映选择性、高区域选择性、反应条件温和、适用范围广及环境友好等众多的优点备受研究者关注。因此,苯乳酸及其催化合成的酶类成为近年来研究的热点。

1988年,lavermicocca等从酸面团中分离得到的l.plantarum21b,产生的d-苯乳酸量为56mg/l,这是首次关于乳酸菌产生苯乳酸的报道。随后研究人员陆续发现不同种属的乳酸菌能够产生苯乳酸,如李兴峰等从泡菜中筛选出112株菌,其中有10株菌产生d-苯乳酸的量超过66.4mg/l。但是由于原始菌株的局限性,其产生苯乳酸的量一般都不高,且不同菌株之间有较大差异,难以达到工业产业化要求。

现有技术中,有研究者发现苯丙酮酸还原酶在催化苯丙酮酸反应12h后,苯丙酮酸的转化率为91.3%。也有研究者应用lactobacillusplantarumcect-221生产苯乳酸,在优化后的培养条件下,2l的发酵罐中发酵培养158h,苯乳酸产量仅为0.7g/l。由此可以看出,采用发酵法制备苯乳酸的产率较低,产物提取困难,而生物转化法制备苯乳酸的底物上载量和产率均有所提高,但是反应时间过长,仍不能达到工业化生产的要求,需要进一步开发高效还原酮酸的酶类。



技术实现要素:

本发明的第一个目的是提供一种苯丙酮酸还原酶氨基酸序列如(a)或(b)所示:

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示;

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述苯丙酮酸还原酶的基因,其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌,是以大肠杆菌为宿主,表达seqidno.1所示苯丙酮酸还原酶基因。

在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌以pet-28a(+)为载体表达所述苯丙酮酸还原酶基因。

在本发明的一种实施方案中,所述的宿主为大肠杆菌e.colibl21(de3)。

在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌按如下步骤构建:(1)将seqidno.1所示基因片段与与pucm-t连接后转化宿主e.colijm109,获得重组质粒命名为pucm-t-lpppr;(2)将pucm-t-lpppr与pet-28a(+)质粒均用ndei和noti进行双酶切,在t4dna连接酶的作用下进行连接,得到重组质粒pet-28a(+)-lpppr;(3)将pet-28a(+)-lpppr转化入e.colibl21(de3)宿主。

本发明的第四个目的是提供所述基因的异源表达方法,所述方法是将所述基因工程菌接种至lb培养基中,于37℃、转速220rpm培养至od600为0.60.8,加iptg至终浓度为0.4-0.6mm进行诱导,1822℃诱导表达79h。

在本发明的一种实施方式中,所述方法具体步骤如下:以含有苯丙酮酸还原酶基因的大肠杆菌e.coli/pet-28a-lpppr为生产菌株,发酵条件为:挑取e.coli/lpppr单菌落接种于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中,于37℃、220r/min培养过夜,按2%的接种量接种到100mllb培养基中,培养温度为37℃、转速220rpm培养至od600为0.6-0.8,加iptg至终浓度为0.4-0.6mm进行诱导,18-22℃诱导表达7-9h。收集菌体,8000rpm离心5min收集菌体,用100mm,ph7.0的磷酸盐缓冲液进行洗涤2-3次,制备成100mg/ml的菌悬液。

本发明还提供一种应用所述苯丙酮酸还原酶制备苯乳酸的方法,是将苯丙酮酸还原酶以16~25u/mmol苯丙酮酸的添加量加入至含葡萄糖和苯丙酮酸的反应体系中。

在本发明的一种实施方式中,所述苯丙酮酸和葡萄糖的质量比为1:0.8~1。

在本发明的一种实施方式中,所述苯丙酮酸是以酶液、酶粉或基因工程菌的形式参与反应。

在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌的酶活为2~5u/mg菌体。

在本发明的一种实施方式中,所述方法是以所述基因工程菌为催化剂,以25mm苯丙酮酸为底物,并加入20mm葡萄糖和50mg湿菌体,于37℃温度下反应。

在本发明的一种实施方式中,所述反应在ph7.0~7.5的磷酸盐缓冲液中进行。

在本发明的一种实施方式中,所述磷酸缓冲液是浓度为0.1mm的na2hpo4-nah2po4,缓冲液。

本发明还提供所述苯丙酮酸还原酶及表达所述苯丙酮酸还原酶的基因工程菌在食品、生物、医药领域的应用。

有益效果:本发明提供了一种苯丙酮酸还原酶,能够显著提高苯丙酮酸的转化效率,使其在以葡萄糖和苯丙酮酸底物的反应体系中,经过5h反应后,底物的转化率达到98.38%,e.e.值为99.9%。

附图说明

图1为反应底物及产物的hplc图谱;

图2为重组质粒pet-28a(+)-lpppr的构建示意图;

图3为转化反应进行图;其中,ppa为苯丙酮酸;pla为苯乳酸。

具体实施方式

苯丙酮酸和苯乳酸标品均购自上海sigma公司;流动相均购自美国tedia天地试剂公司,高效液相色谱柱c-18(4.6×250mm,5μm)购自德国bischoff有限公司。采用高效液相色谱仪waterse2695(美国waters公司)对样品进行分析。流动相为均含有0.05%的三氟乙酸的甲醇(b)和水(a)的混合液,梯度洗脱程序为:0~15min由20%b线性变化至65%b,15~16min由65%b线性变化至100%并保持3min,19~20min由100%b线性变化至20%,流速1ml/min,检测波长210nm,柱温30℃。检测器为紫外检测器,色谱柱为c18柱。苯丙酮酸及苯乳酸的出峰时间如图1所示,苯丙酮酸的出峰时间为11.790min,苯乳酸的出峰时间为12.831min。

酶活测定方法:反应在30℃条件下,连续测定3min在340nm吸收值的变化。酶活定义为:在30℃、ph7.0的条件下,每分钟消耗1μmolnadh所需的酶量为一个酶活单位(1μmol/min=1u)

实施例1植物乳杆菌苯丙酮酸还原酶基因的获得及表达质粒的构建

设计特异性引物:

lpppr-f:5’-catatgatgaaaattttaatgtat-3’,含ndei酶切位点。

lpppr-r:5’-gcggccgcttaaaaggcgtgggccgt-3’,含noti酶切位点。

提取植物乳杆菌的基因组dna,以植物乳杆菌基因组dna为模板,lpppr-f和lpppr-r为引物,进行pcr:94℃变性5min,30个循环(94℃30s、50℃30s和72℃60s),72℃保温10min。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析、割胶回收目的基因,与pucm-t连接,转化e.colijm109,经蓝白斑筛选、菌液pcr鉴定和dna测序。将测序正确的重组质粒命名为pucm-t-lpppr。将测序正确的pucm-t-lpppr与pet-28a(+)质粒均用ndei和noti进行双酶切,割胶回收的酶切产物在t4dna连接酶的作用下进行连接,得到重组质粒pet-28a(+)-lpppr,并对重组质粒进行序列测定;将pet-28a(+)-lpppr转化入e.colibl21(de3)中。

实施例2重组菌的诱导表达及条件优化

将e.colibl21-lpppr单菌落接种于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中,于37℃、220r/min培养过夜;按2%接种量转接于100mllb培养基中,37℃培养至od600为0.6~0.8时,对目的蛋白进行的诱导表达。诱导条件为:添加iptg至终浓度0.4-0.6mmol/l,18-22℃诱导7-9h。收集菌体,用磷酸钠缓冲液(na2hpo4-nah2po4,100mmol/l,ph7.0)洗涤2-3次,加入同样缓冲液悬浮得到菌浓为100mg/ml的菌悬液。对反应后的笨乳酸浓度进行测定,结果显示,d-苯乳酸浓度达7.05~7.79mm。

实施例3d-苯乳酸的制备

在1.5mlep管中加入400μl苯丙酮酸(终浓度25mm),再加入100μl葡萄糖(终浓度为20mm),加入500μl菌悬液(酶活为19.7u/mg湿菌体),40℃反应5h。定时取样至甲醇中进行稀释,离心后过0.22μm有机滤膜,进hplc进行检测。反应进程曲线如图2所示,在反应210min后,苯丙酮酸含量已低于5mm,在反应进行5h后苯丙酮酸的转化率为98.38%,e.e.>99.9%,d-苯乳酸产量达到4.15g/l。

对照例1

按实施例2的方式对重组菌进行诱导,区别在于调整诱导温度为16℃,在其余条件相同的条件下,d-苯乳酸浓度仅6.55~6.62mm。

对照例2

按实施例2的方式对重组菌进行诱导,区别在于调整诱导温度为25℃,在其余条件相同的条件下,d-苯乳酸浓度仅4.35~5.01mm。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的。

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