本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用。
背景技术：
：诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscells)最初是日本人山中申弥(shinyayamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因(oct4,sox2,klf4和c-myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。ips细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。人类ips细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在体外，ips细胞可定向诱导分化出多种细胞，比如神经干细胞、肝脏干细胞、心肌干细胞等，因此，ips细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。在诱导多能干细胞增殖分化过程中会分泌出多种生长因子、蛋白质、活性多肽、微量元素等促进细胞生长、活化、再生等的物质。虽然诱导多能干细胞分泌素的市场潜力很大，但其大量培养存在着较大困难，目前报道尚未多见。中国专利cn102732586b公开了一种间充质干细胞分泌素的制备方法，所述制备方法包括细胞培养，分泌素溶液收集培养，纯化，浓缩，利用了生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素，大幅缩减成本及所需空间，提高了充质干细胞细胞分泌素的产量。中国专利申请cn101461772a公开了用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，所述制备方法包括细胞分离、干细胞扩增、干细胞因子体系的获取和浓缩、贮存，该发明简单易行，适宜大规模生产。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用。本发明提供的诱导多能干细胞分泌素的制备方法简单易行，适宜大规模生产，有效提高了诱导多能干细胞分泌素的产量。本发明提供了一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法，包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液中，在37℃、5％co2条件下培养24-72h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用磷酸缓冲液冲洗诱导多能干细胞和三维载体2-4次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液继续培养6-24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，浓缩，即得。本发明诱导多能干细胞分泌素通过超膜过滤，截留分子量为30kd，浓缩后所得的多种生命活性物，其包括蛋白质、多肽及生物活性因子等多种成分。诱导多能干细胞分泌素中的多种生命活性成分具有复杂的生理作用，每种成分都可以对许多组织器官产生影响，同时每种形式生理机能的提高也不是单一因子的作用，而是需要多种因子的相互协调作用。该分泌物具有促进细胞增殖、分化、凋零，防止细胞衰老，参与免疫调节，抗氧化等作用。进一步地，所述步骤s2中细胞培养基包括基础培养基imdm/f12和添加剂；其中，添加剂为2-4mg/ml人白蛋白、40-60μg/ml维生素c和3-7mg/ml人参皂苷单体rb1。人参皂苷单体rb1可以显著提高诱导多能干细胞诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖。进一步地，所述步骤s2中细胞培养基由基础培养基imdm/f12和添加剂组成；其中，添加剂为3mg/ml人白蛋白、50μg/ml维生素c和5mg/ml人参皂苷单体rb1。进一步地，所述步骤s2中诱导多能干细胞密度为1×108-1×109个/l。进一步地，所述步骤s3中基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液的体积比为1:(2-6)。进一步地，所述步骤s3中磷酸缓冲液的浓度为0.01m，ph值为7.3。进一步地，所述步骤s4中浓缩方式为通过切向流过中控纤维超滤柱，体积浓缩1/8。同时，本发明制得的诱导多能干细胞分泌素可用于保健品或化妆品中。与现有技术相比，本发明提供的诱导多能干细胞分泌素的制备方法简单易行，适宜大规模生产，有效提高了诱导多能干细胞分泌素的产量，且在抗衰老、抑制黑色素及修复受损细胞的应用中效果较好。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，这些实施例仅用于例证的目的，并不限制于本发明的保护范围。实施例1一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液imdm/f12+2mg/ml人白蛋白+40μg/ml维生素c+3mg/ml人参皂苷单体rb1中，在37℃、5％co2条件下培养24h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01m的磷酸缓冲液(ph＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体2次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液(体积比为1:2)继续培养6h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。实施例2一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml维生素c+5mg/ml人参皂苷单体rb1中，在37℃、5％co2条件下培养48h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01m的磷酸缓冲液(ph＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液(体积比为1:4)继续培养15h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。实施例3一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液imdm/f12+4mg/ml人白蛋白+60μg/ml维生素c+7mg/ml人参皂苷单体rb1中，在37℃、5％co2条件下培养72h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01m的磷酸缓冲液(ph＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液(体积比为1:6)继续培养24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。对比例1一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+5.05mg/ml维生素c中，在37℃、5％co2条件下培养48h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01m的磷酸缓冲液(ph＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液(体积比为1:4)继续培养15h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。与实施例2的区别在于，步骤s2中诱导多能干细胞培养液里未添加人参皂苷单体rb1，增加了维生素c的用量。对比例2一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：s1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；s2将步骤s1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml维生素c+5mg/ml人参皂苷单体rb1中，在37℃、5％co2条件下培养48h，得诱导多能干细胞；s3在步骤s2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01m的磷酸缓冲液(ph＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液imdm/f12与磷酸缓冲液(体积比为1:4)继续培养15h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；s4将步骤s3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，常规浓缩1/8，即得。与实施例2的区别在于，将步骤s4中通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩替换为常规浓缩。试验例一、体外抗衰老试验1.试验材料：实施例1-3及对比例1-2制备的诱导多能干细胞分泌物。2.试验方法：取人皮肤成纤维母细胞(hdf细胞)，用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培养基配制hdf细胞悬液，得到4×104cell/ml细胞悬液，分别注入3块96孔培养板内，每孔100μl，每处理组别设复孔4孔，置于含5％(v/v)co2、37℃的恒温培养箱内培养24h。24h后弃原培养液，分别加入含1μg/ml的诱导多能干细胞分泌物的1640培养液100μl，设含15％新生牛血清的1640培养液100μl为培养基对照组，设不含有新生牛血清的1640培养液为空白对照组，放入37℃、5％co2培养箱中分别培养24h、72h、120h、168h。各观察期终止时，加入20μl/孔的mtt液，继续培养6h，吸去原液，加入150μl/孔二甲基亚砜。震荡10min，在免疫酶标仪上以490nm波长测定吸光度。按下列公式计算细胞相对存活率(rgr)：其中0h的细胞活力作为100％。3.试验结果：诱导多能干细胞分泌物对hdf细胞相对存活率的影响结果见表1。表1诱导多能干细胞分泌物对hdf细胞相对存活率的影响由表1可知，本发明制备的诱导多能干细胞分泌物对hdf细胞作用24-168h，没有细胞毒性作用，反而具有促进hdf细胞增殖的作用。与对比例1-2相比，本发明制备的诱导多能干细胞分泌物对hdf的生长的促进作用较明显且在120h时达到高峰，说明本发明提供的诱导多能干细胞分泌物的制备方法较好，且本发明制备的诱导多能干细胞分泌物不会对细胞产生不正常的增生，对人体的使用安全性高。试验例二、黑色素生成抑制效果试验1.试验材料：实施例1-3及对比例1-2制备的诱导多能干细胞分泌物。2.试验方法：使用小鼠恶性黑色素瘤细胞。使用含有胎牛血清10％的eagle’smem培养基)，在co2培养箱(5％co2、37℃)内培养。将小鼠恶性黑色素瘤细胞制成细胞浓度3×105个/ml的悬浮液，将该悬浮液1ml注入含有培养基9ml的100mm培养皿中。第二天替换为分别含有1μg/ml的诱导多能干细胞分泌物的培养基，培养4天。培养结束后，刮取细胞，各组的细胞数总计为5×106个，进行离心。添加1mol/lnaoh500ml溶解后，测定其溶解液405nm处的吸光度。将无添加组作为100％，计算各组的黑素生成抑制率。3.试验结果：黑素生成抑制率结果如表2所示。表2黑色素生成抑制结果组别实施例1组实施例2组实施例3组对比例1组对比例2组抑制率/％57.862.052.746.543.1由表2可知，本发明制备的诱导多能干细胞分泌物能有效抑制黑色素生成，具有良好的美白效果。与对比例1-2相比，本发明实施例1-3制备的诱导多能干细胞分泌物抑制黑色素生成的效果较好，说明本发明的诱导多能干细胞分泌物制备方法制得的诱导多能干细胞分泌物中抑制黑色素生成的有效成分含量较多。试验例三、对紫外照射后细胞的修复作用用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培养基(青霉素200u/ml、链霉素200u/ml，ph＝7.2)培养人包皮成纤维细胞(hff，atcc)至融合度为80％左右时，换用含1％(v/v)fbs的1640培养基，每天在紫外线下照射2h。阴性对照组用锡纸包住细胞培养瓶。细胞照射完四天后，观察发现细胞开始出现皱缩，开始有个别的细胞漂浮在培养基中。第五天，用含1％(v/v)fbs的1640培养基稀释各样品，诱导多能干细胞分泌物高剂量组终浓度为100μg/ml，低剂量终浓度为1μg/ml；阳性对照组(即紫外照射后不加提取物)加入含1％(v/v)fbs的1640培养基。继续培养24h，观察细胞形态。结果表明，本发明制备的诱导多能干细胞分泌物对紫外照射造成的细胞损伤具有显著的修复作用。由以上试验可知，本发明制备的诱导多能干细胞分泌物对人体安全，且能够抗衰老、抑制黑色素的生成及修复受损细胞等，可用于保健品或化妆品中。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12