一种植物甾醛类化合物的分离精制方法与流程

本发明涉及一种植物甾醛类物质的分离精制方法，尤其涉及用大孔吸附树脂色谱分离和低温结晶法，从植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩浸膏中，分离精制植物甾醛类物质的工艺。属植物甾醇发酵液中生化分离甾醛类物质技术领域。

背景技术：

植物甾醇发酵得到雄烯二酮（简称4ad）的过程中，会有一些有用的副产物的产生；发酵液在分离主要产品雄烯二酮之后，结晶母液中还含有某些具有很高应用价值的产物，如植物甾醛类化合物（简称ba），约含19%（见附图1），如直接舍弃，不仅是对资源的浪费，同时也会对环境造成污染。

ba全称bisnorcholenaldehyde，目前暂无公认的中文译名，其结构如下式所示，因其结构含有甾核和醛基，所以将其归为植物甾醛类化合物。

ba是合成黄体酮过程中一种重要中间体，近年来有专利提出ba在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，水合醋酸铜和2，2’-联吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，进行氧化脱羧反应制备黄体酮，具有产品收率高，工艺简单，生产成本低等优点。而此工艺的快速发展将促使ba的需求量急剧增长。

ba是合成黄体酮过程中一种重要中间体，黄体酮在临床上具有非常重要的用途，可以治疗由于黄体功能不全引起的先兆性流产、习惯性流产等症。此外，黄体酮还是皮质激素、雄激素和雌激素的前体，是合成一切类固醇激素的中间产物，具有非常重要的应用价值。传统的黄体酮有机合成方法步骤多、收率低、成本高；因此，黄体酮的价格一直居高不下，而ba作为合成黄体酮过程中一种重要中间体，高纯度ba的价格也很高。

目前有学者提出以植物甾醇发酵产物（20s）-20-羟甲基孕-4-烯-3-酮为原料合成黄体酮的工艺，此方法不仅要先从植物发酵产物中提取高纯度（20s）-20-羟甲基孕-4-烯-3-酮，而且要用二甲基硫醚和n-氯代丁二酰亚胺的混合物将其氧化得到ba，然后在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，水合醋酸铜和2，2’-联吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，进行氧化脱羧反应制备黄体酮。此工艺中获得ba的纯度和收率都会降低，得到的ba的结构也有可能发生改变。因此，从发酵液中直接提取ba做为黄体酮的合成原料更加经济可行。在上个世纪80年代中期，就有日本学者提出用酸性亚硫酸盐处理植物甾醛类物质，然后用离子交换树脂分离得到高纯度的植物甾醛类化合物单体，纯度可以达到95%。该工艺的主要不足在于：1.植物甾醛类化合物在经过衍生化和还原之后，化学结构可能会发生较大的改变；2.纯度不够高，无法达到工业合成的纯度需求，同时也加重了后续分离纯化工艺的压力。传统可用于非极性化合物（植物甾醛类化合物也属于非极性化合物）的分离方法还有硅胶层析，但硅胶分离工艺存在一些明显的不足之处：1.使用大量有机溶剂，易对环境会造成污染；2.硅胶可重复使用性不高，增加生产成本；3.结晶母液浓缩浸膏含量较低，使用硅胶分离处理量少；4.硅胶层析工艺条件波动较大，难以控制。

甾体类激素作为仅次于抗生素的第二大药物，一直以来由于生产成本及提取工艺等问题制约，市场需求远远大于产能。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种工艺路线简单、生产成本低廉、符合环保要求；所得产品纯度高，符合医药行业黄体酮合成需求的ba纯化精制技术方案。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：以ba含量约为19%的植物甾醇发酵液结晶母液浓缩浸膏为生产原料，经过大孔吸附树脂层析初步纯化后，洗脱液洗脱、旋转蒸发干燥、再冷却结晶，获得纯度大于98.5%的ba的工艺路线。

一种植物甾醛类化合物的分离提纯方法，包括对植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩浸膏，用大孔吸附树脂色谱分离和低温结晶法提纯，其特征在于：依次包括下述步骤：

1）取骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂，大部湿法装柱；

2）以植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩液浸膏为原料，用少量低碳醇完全溶解，过滤去杂；滤液中再加入步骤1）预留的少量大孔吸附树脂，拌匀并旋去溶剂后小心加到步骤1）所述大孔吸附树脂柱的顶层，干法上样；

所述低碳醇为甲醇、乙醇或异丙醇；

3）大孔吸附树脂柱层析，先以低浓度的乙醇水溶液淋冼除杂，再用高浓度乙醇水溶液洗脱；所述低浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为40%～60%，所述高浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为70%～100%；

4）步骤3）所述洗脱液在65℃以下经旋转蒸发至无溶剂，再由乙腈、甲醇、水混合液溶解，置于-15～5℃低温下冷却结晶；所述的乙腈、甲醇、水混合液的比例为（15～20）︰3︰1

进一步的，所述的大孔吸附树脂是苯乙烯-二乙烯苯骨架结构的hz-816、hz-818、hz-826、hz801。

进一步的，所述的大孔吸附树脂，其规格为50～80目或80～120目。

本发明的积极效果是：1.工艺路线简单，易于工业化放大；2.所得产品纯度高，达98.5%以上，符合医药行业需求；3.由于大孔吸附树脂可以再生使用，过程中使用的溶剂主要为低碳醇和水溶液，所以生产成本低廉；4.ba的市场价值较高，而原料为植物甾醇提取4ad后废弃的结晶母液浓缩浸膏，使得资源再利用，同时提高企业利润；5.工艺过程无污染，无废水，符合环保要求。本发明的实施对于甾体类药物的生产发展具有推动作用，对企业拥有显著的经济效益，对社会医疗保障具有很大的积极意义。

附图说明

图1为结晶母液浓缩浸膏高效液相色谱图；

图2为纯化后产品的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明所用的原料为植物甾醇经分歧杆菌发酵得到的发酵液，再经萃取、结晶等步骤提取雄烯二酮（简称4ad）之后的结晶母液浓缩浸膏，其高效液相色谱图图1。由图可见发酵液在分离主要产品雄烯二酮之后，结晶母液中还含有某些具有很高应用价值的产物，如植物甾醛类化合物（简称ba），约含19%。如直接舍弃，不仅是对资源的浪费，同时也会对环境造成污染。实施例中所用旋转蒸发仪型号为bc-r205c，所用的高效液相为agilent1100，检测条件如下：柱温箱温度为30℃；检测波长为254nm；色谱柱为安捷伦c184.6×100mm，3.5μm色谱柱；流动相为甲醇∶水（65:35），流速为1ml/min。实施例中釆用的大孔吸附树脂是指上海华震科技有限公司产品hz-816、hz-818、hz-826、或hz801，规格为50～80目或80～120目。

实施例1：

取30ml50目-80目的hz-816型大孔吸附树脂，预留4ml树脂，其余采用湿法装柱，倒入树脂柱中。取1.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入预留的4ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用14倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含ba的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于0℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.15g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.6%。

实施例2：

取30ml80目-120目的hz-826型大孔吸附树脂，预留3ml树脂，其余采用湿法装柱倒入树脂柱中。取1.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的3ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用13倍50%乙醇溶液，以1ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含ba的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（15:3:1）溶解，趁热过滤，置于4℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.16g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.8%。

实施例3：

取50ml50目-80目的hz-826大孔吸附树脂，采用湿法装柱，剩余5ml树脂，其余倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的5ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用13倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含ba的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（17:3:1）溶解，趁热过滤，置于-10℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.18g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.5%。

实施例4：

取50ml80目-120目的hz-816大孔吸附树脂，采用湿法装柱，剩余3ml树脂，其余倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的3ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用18倍50%乙醇溶液，以2.5ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含ba的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于4℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.11g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为99.0%。

实施例5：

取50ml80目-120目的hz801型大孔吸附树脂，预留5ml树脂，其余采用湿法装柱倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的5ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用8倍50%乙醇溶液，以0.5ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含ba的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于-20℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.23g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.9%。