本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)及其用途。
背景技术：
：肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其中80％-85％为非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer，nsclc)。随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，靶向治疗成为研究热点，包括egfr、kras、alk等多个基因靶点。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是目前肿瘤治疗的重要靶点。egfr基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成，其转录编码的跨细胞膜糖蛋白的胞内区具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase，tk)活性，可通过2条途径将信号传递至细胞核，一条是ras->raf->mapk，一条是pi3k->pkc->ikk途径，进而调节核内基因转录水平，影响细胞的增殖、迁移、分化、血管新生。egfr信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。egfr基因突变主要发生在胞内tk区域的4个外显子上(18-21外显子)，研究表明，其中18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,tkis)类药物的疗效较好，20外显子发生的突变常与一代、二代egfr-tkis耐药相关，但是对3代egfr-tkis类药物敏感。中国肺癌患者中，egfr突变率约为30％-50％，其中18外显子上的点突变约占egfr突变类型的5％左右，19外显子上发生的多种缺失突变约占egfr突变类型的45％左右，20外显子上发生的t790m点突变约占egfr突变类型的5％左右，21外显子上发生的l858r、l861q点突变约占egfr突变类型的40％-45％。kras基因(kirsten-rousaviansarcoma)是ras基因家族成员，位于12号染色体的12p12.1位置，编码产物为21kd的kras蛋白，参与egfr信号传导过程。kras基因突变可导致ras异常活化，诱发肿瘤。多个临床研究结果提示，kras基因第2号外显子第12、13位密码子的突变状态与患者服用egfr-tkis类药物的疗效密切相关，携带kras突变的患者对上述药物的疗效明显降低。在中国肺癌患者中，kras基因突变率约为2％-10％。棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike4-anaplasticlymphomakinase，eml4-alk)基因的融合是非小细胞肺癌中多见的融合类型，发生率为3％-5％，多见于非(轻度)吸烟肺癌患者中。eml4-alk融合导致编码跨膜酪氨酸激酶受体的alk基因持续表达，从而激活alk酪氨酸激酶区及下游pi3k/akt及mapk等信号通路，引起肺癌的发生。临床研究表明，alk激酶抑制剂通过竞争性结合于alk激酶区域，阻断了alk下游的信号转导通路，从而使具有eml4-alk的患者从alk激酶抑制剂的治疗中获益。现行肺癌基因突变检测方法有：(1)sanger测序方法概念：sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以a、t、c、g结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得可见的dna碱基序列。测序原理：利用一种dna聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dntp)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddntp)。由于ddntp缺乏延伸所需要的3-oh基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在g、a、t或c处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dntps和ddntps的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用x-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。sanger法优缺点优点：方法简便，操作简单。缺点：dna模板的组成或二级结构有时引起dna聚合酶不正常终止。(2)arms-pcr方法概念：突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)又称等位基因特异性扩增法(allelespecificamplification,asa)，是newton等首先建立用来检测已知突变的方法。arms-pcr原理：taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定条件下pcr引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过pcr方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。arms-pcr优缺点优点：灵敏度高，数据分析要求低。缺点：覆盖度小，试剂成本高。关于肺癌的遗传机制很复杂，其中既有dna突变，也有rna融合。现有技术单独检测dna突变或rna融合，存在局限性。dna突变和rna融合检测的结合，又会增加经济及时间成本。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)及其用途。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)，所述试剂盒中包括dnapcr引物和rnapcr引物，所述dnapcr引物包括kras基因突变检测引物对、egfr基因突变检测引物对，所述rnapcr引物包括alk基因融合检测引物对。优选地，所述kras基因突变检测引物对的检测位点包括：c.35g>ap.g12d；c.35g>cp.g12a；c.35g>tp.g12v；c.34g>ap.g12s；c.34g>cp.g12r；c.34g>tp.g12c；c.38g>ap.g13d；所述egfr基因突变检测引物对的检测位点包括：c.2573t>gp.l858r；c.2582t>ap.l861q；c.2235_2249delp.e746_a750del；c.2236_2250delp.e746_a750del；c.2156g>cp.g719a；c.2369c>tp.t790m；所述alk基因融合检测引物对的检测位点包括eml4(13)-alk(20)。优选地，所述kras基因突变检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物。所述kras基因突变检测引物对的检测位点包括：c.35g>ap.g12d；c.35g>cp.g12a；c.35g>tp.g12v；c.34g>ap.g12s；c.34g>cp.g12r；c.34g>tp.g12c；c.38g>ap.g13d。优选地，所述egfr基因突变检测引物对包括第一检测引物对、第二检测引物对、第三检测引物对和第四检测引物对，所述第一检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物，所述第二检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的反向引物，所述第三检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的反向引物，所述第四检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的反向引物。所述第一检测引物对的检测位点包括c.2573t>gp.l858r和c.2582t>ap.l861q；所述第二检测引物对的检测位点包括c.2235_2249delp.e746_a750del、c.2236_2250delp.e746_a750del。所述第三检测引物对的检测位点包括c.2156g>cp.g719a。所述第四检测引物对的检测位包括c.2369c>tp.t790m。优选地，所述alk基因融合检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的反向引物。所述alk基因融合检测引物对的检测位点包括eml4-alk。本发明的试剂盒可同时检测dna突变和rna融合，检测引物对的设计是本发明试剂盒的关键。本发明的试剂盒是基于iontorrent平台的高通量测序技术来进行检测的，所以试剂盒中还包括一些基于iontorrent平台的高通量测序所需要的常规试剂，如：文库引物混合液、hifipcr混合液、fupa试剂、连接缓冲液、dna连接酶、hifi酶混合液、洗脱缓冲液、接头、标签n(n＝1，2…96)等等。进一步地，所述试剂盒还包括逆转录酶、逆转录酶缓冲液。进一步地，所述试剂盒中还含有阳性对照。例如：dna阳性对照、rna阳性对照。进一步地，所述试剂盒中还含有阴性对照。例如：阴性对照。本发明的一种具体实施方式中，列举了试剂盒中的主要组成成分及其规格为：本发明的第二方面，提供了前述试剂盒的使用方法，包括步骤：(1)获取样本核酸，所述核酸是dna或rna，若核酸为rna则先将其进行反转录为cdna；(2)制备基因文库：1)多重pcr：将步骤(1)所获得的dna采用包括dnapcr引物混合液的pcr反应体系进行pcr扩增，获得dnapcr扩增产物；将步骤(1)所获得的cdna采用包括rnapcr引物混合液的pcr反应体系进行pcr扩增，获得cdnapcr扩增产物；2)消化部分引物序列：将步骤1)所获得的dnapcr扩增产物和cdnapcr扩增产物，采用fupa试剂消化，获得消化后的目标产物；3)连接接头和标签：接下来将经过fupa试剂消化的目标产物进行连接接头和标签；4)片段筛选：接下来采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选得到片段集中的dna，将hifi酶混合液和文库引物混合液混合均匀，进行洗脱；5)文库扩增：接下来将连接了接头和标签的dna进行pcr扩增；6)文库片段选择：将pcr扩增后的产物采用磁珠进行纯化做核酸片段筛，获得基因文库。本发明的第三方面，提供前述试剂盒在制备肺癌基因突变与融合检测产品中的用途。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)，能够同时检测dna突变和rna融合，灵敏度高，检测限低，特异性高，重复性好，准确率及阳性符合率均高达100％。具体实施方式高通量测序方法高通量测序技术(high-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术("next-generation"sequencingtechnology)，以能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定和一般读长较短等特征标志。基因突变genemutation即基因组dna分子发生的突然的、可遗传的变异现象。基因融合rnafusion是指两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1试剂盒的组成及制备本发明的人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)中包括dnapcr引物混合液和rnapcr引物混合液，如下表1-1所示，所述dnapcr引物包括kras基因突变检测引物对、egfr基因突变检测引物对，所述rnapcr引物包括alk基因融合检测引物对，所述kras基因突变检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物，所述egfr基因突变检测引物对包括第一检测引物对、第二检测引物对、第三检测引物对和第四检测引物对，所述第一检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物，所述第二检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的反向引物，所述第三检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的反向引物，所述第四检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的反向引物，所述alk基因融合检测引物对包括核苷酸序列如seqidno.11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的反向引物。本发明的试剂盒是基于iontorrent平台的高通量测序技术来进行检测的，所以试剂盒中还包括一些基于iontorrent平台的高通量测序所需要的常规试剂，如：文库引物混合液、hifipcr混合液、fupa试剂、连接缓冲液、dna连接酶、hifi酶混合液、洗脱缓冲液、接头、标签n(n＝1，2…96)等等。进一步地，所述试剂盒还包括逆转录酶、逆转录酶缓冲液。进一步地，所述试剂盒中还含有阳性对照。例如：dna阳性对照、rna阳性对照。进一步地，所述试剂盒中还含有阴性对照。例如：阴性对照。可采用本发明试剂盒中的包括dnapcr引物和rnapcr引物，对样本中的dna检测位点和rna检测位点进行扩增，然后采用iontorrent平台对扩增产物进行高通量测序。表1-1实施例2试剂盒及其使用性能评估试验一、试剂盒的组成：本实施例提供本发明试剂盒的一种具体的实施方式，在该具体的实施方法中，本发明的人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)的主要组成成分如下表1-2所示，但是并不局限于此，只要人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)中包括表1-1中所示的dnapcr引物和rnapcr引物即可：表1-2主要组成成分规格文库引物混合液192μl/管，1管hifipcr混合液384μl/管，1管fupa试剂192μl/管，1管连接缓冲液384μl/管，1管dna连接酶192μl/管，1管hifi酶混合液1600μl/管，3管dnapcr引物混合液192μl/管，1管rnapcr引物混合液192μl/管，1管洗脱缓冲液12ml/管，1管逆转录酶48μl/管，1管逆转录酶缓冲液96μl/管，1管接头192μl/管，1管标签n(n＝1，2…96)2μl/管，96管dna阳性对照8μl/管，1管阴性对照16μl/管，1管rna阳性对照50ng/管，2管文库纯化磁珠960μl/管，16管其中，上表1-2中的dnapcr引物混合液为将dnapcr引物溶于lowte中获得，rnapcr引物混合液为将rnapcr引物溶于lowte中获得。所述dnapcr引物混合液和所述rnapcr引物混合液用于目的片段扩增。采用nanodrop检测dnapcr引物混合液及rnapcr引物混合液的浓度，结果dnapcr引物混合液中各dnapcr引物的浓度≥4000ng/ul，rnapcr引物混合液中rnapcr引物的浓度浓度≥1000ng/ul，均符合使用要求。qpcr检测结果，每个qpcr孔中ct值＜35，表示dnapcr引物混合液和rnapcr引物混合液中含有目标引物。上表1-2中，所述文库引物混合液用于对连接了接头和标签的dna进行文库扩增。所述文库引物混合液可以是本领域的常规试剂，功能同ionlibraryamplificationprimermix。上表1-2中的逆转录酶及逆转录酶缓冲液，为本领域常规使用的反转录试剂，只要能够满足对rna进行反转录的要求即可。以发生eml4(13)-alk(20)融合的rna作为模板，进行反转录，检测cdna扩增情况，qpcr检测反转录试剂性能。结果如表2显示，所述逆转录酶及逆转录酶缓冲液符合使用要求。表2上表1-2中的阴性对照，亦即阴性质控品，nanodrop检测的浓度≥90ng/ul，纯度：od260/280在1.6-2.0之间，1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小在200bp以上，proton测序结果不存在本发明试剂盒要检测的基因位点突变，符合作为阴性对照的要求。上表1-2中的rna阳性对照，亦即rna阳性质控品，含有本发明试剂盒要检测的基因融合位点，符合作为rna阳性对照的要求。上表1-2中的dna阳性对照，亦即dna阳性质控品，含有本发明试剂盒要检测的基因突变类型，符合作为dna阳性对照的要求。上表1-2中，hifipcr混合液和hifi酶混合液用于对常规模板和高难度模板进行超高保真扩增，hifipcr混合液，功能同ionampliseqtmhifimastermix，通过多重pcr获得目标产物；hifi酶混合液，功能同kapahifi高保真dna聚合酶。上表1-2中，fupa试剂用于对dna片段进行消化，功能同fupareagent。二、上述试剂盒的使用方法，可包括如下步骤：(1)获取样本核酸，所述核酸是dna或rna，若核酸为rna则先将其进行反转录为cdna；(2)制备基因文库：1)多重pcr：将步骤(1)所获得的dna采用包括dnapcr引物混合液的pcr反应体系进行pcr扩增，获得dnapcr扩增产物；将步骤(1)所获得的cdna采用包括rnapcr引物混合液的pcr反应体系进行pcr扩增，获得cdnapcr扩增产物；2)消化部分引物序列：将步骤1)所获得的dnapcr扩增产物和cdnapcr扩增产物，采用fupa试剂消化，获得消化后的目标产物；3)连接接头和标签：接下来将经过fupa试剂消化的目标产物进行连接接头和标签；4)片段筛选：接下来采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选得到片段集中的dna，将hifi酶混合液和文库引物混合液混合均匀，进行洗脱；5)文库扩增：接下来将连接了接头和标签的dna进行pcr扩增；6)文库片段选择：将pcr扩增后的产物采用磁珠进行纯化做核酸片段筛，获得基因文库。然后可进行文库检测：用q-pcr检测扩增产物的浓度，当文库浓度高于proton上机浓度(6pm)时，即可用于ionprotontm测序平台。三、试剂盒的使用性能评估试验：1、最低检测限方案13份dna阳性参考品样本，用野生型样本将其突变频率稀释至检测限附近，制备基因文库，proton上机测序；1份rna阳性参考品样本，用野生型样本将其cp100k稀释至检测限附近，制备基因文库，proton上机测序。判断标准：高于检测限的突变或融合应全部检测到。dnapcr引物的最低检出限(为0.05)结果如表4所示：表4rnapcr引物的最低检出限(为25)结果如表5所示：表5基因位点cp100k检测结果alkeml4(13)-alk(20)162阳性2、重复性评估方案2.1dnapcr引物检测：选取2种突变类型，即egfr(c.2236-2250del15p.e746_a750delelrea)以及egfr(c.2573t>gp.l858r)，无核酸酶水稀释至相同浓度，等质量混合参照建库试剂盒成品检。混合后的样本，2个实验操作人员连续10天，分别重复建库10次，分别在2台proton上机测序。判断标准：测序结果中每个突变都应检测到。dnapcr引物的重复性：表62.2rnapcr引物检测：选取突变类型eml4(13)-alk(20)，2个实验操作人员连续10天，分别重复建库10次，分别在2台proton上机测序。判断标准：测序结果中每个突变都应检测到。rnapcr引物重复性：表73、阴阳质控品：dna和rna阴阳质控品各检测一次，一次proton上机测序判断标准：测序结果与原有结果一致。结果：测序结果均与原有结果一致。4、特异性：10份dna阴性样本和10份rna阴性样本，按照sop分别建库一次，一次proton上机测序。判断标准：要求测序结果均为阴性。结果：测序结果均为阴性。5、阳性符合率：13份dna阳性样本和1份rna阳性样本，按照sop分别建库一次，一次proton上机测序。判断标准：要求测序结果均为阳性。dnapcr引物阳性符合率为100％：表8rnapcr引物阳性符合率为100％：表9综上所述，本发明的人类多基因突变检测试剂盒(高通量测序法)灵敏度高，特异性高，重复性好，准确率及阳性符合率均高达100％。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。sequencelisting<110>上海鹍远生物技术有限公司<120>人类多基因突变检测试剂盒（高通量测序法）<130>172305<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>kras基因突变检测正向引物<400>1tacctctattgttggatcatattcgtcca29<210>2<211>30<212>dna<213>artificial<220><223>kras基因突变检测反向引物<400>2tattataaggcctgctgaaaatgactgaat30<210>3<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第一检测引物对正向引物<400>3gccaggaacgtactggtgaaaa22<210>4<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第一检测引物对反向引物<400>4tgacctaaagccacctccttactt24<210>5<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第二检测引物对正向引物<400>5taacgtcttccttctctctctgtcat26<210>6<211>25<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第二检测引物对反向引物<400>6agcagaaactcacatcgaggatttc25<210>7<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第三检测引物对正向引物<400>7tcttacacccagtggagaagct22<210>8<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第三检测引物对反向引物<400>8tgtgccagggaccttaccttata23<210>9<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第三检测引物对正向引物<400>9gaagcctacgtgatggcca19<210>10<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突变检测第三检测引物对反向引物<400>10ttgtctttgtgttcccggacat22<210>11<211>27<212>dna<213>artificial<220><223>alk基因融合检测引物对正向引物<400>11cctgggaaaggacctaaaggtgtatat27<210>12<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>alk基因融合检测引物对反向引物<400>12ccgaatgagggtgatgtttttc22当前第1页12