本发明涉及一种乙烷-1,2-双救必应酸酯及其应用，具体说是一种乙烷-1,2-双救必应酸酯及其在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用，属于医药领域。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，肿瘤患者死亡原因大多为恶性肿瘤晚期转移所致。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过各种转移方式，到达继发组织或器官得以继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程。肿瘤转移过程十分复杂，即肿瘤细胞会随机的从原发母体瘤灶中脱离出来；随后分泌出的某些酶将基底膜降解掉之后浸入并在血管的内皮细胞中稍作停留；进入人体的血液循环系统，并随着血液到达其他部位的血管壁并且会停留在此处；之后某些肿瘤细胞再透过血管进入到细胞外的基质中去，最终在某些组织或者器官处形成能够转移的肿瘤转移灶。因此，肿瘤手术后的“亚健康人”体内残留的循环肿瘤细胞是将来肿瘤发生转移的致命根源。因此，肿瘤转移的防治面临着非常严峻的挑战，如何阻断肿瘤的浸润转移是提高肿瘤治疗水平及治愈肿瘤的关键。
目前临床使用抗肿瘤药物绝大数为化疗药物，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等，而这些细胞与组织是人体重要的免疫防御系统，破坏了人体的免疫系统，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。化疗药物大多缺乏选择性，体内分布广泛，易引发毒副作用，导致患者不能耐受，降低药物疗效。因此，近年来人们一直致力于新型抗肿瘤药物的研究，其中有效抑制肿瘤细胞转移的药物是一个新的药物开发方向。
救必应酸主要存在于中药救必应(ilicisroutundaecortex)中，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、保肝、抗炎、抗病毒、降血糖等。近些年来，救必应酸尤以其低毒高效的特点及多样化的抗癌作用机制日益受到人们重视，显示出较大的临床应用潜力和良好的应用前景。为了进一步提高救必应酸的抗肿瘤活性及减少细胞毒性，因此通过对救必应酸的结构进行修饰。我们的研究已经证明了救必应酸具有预防和治疗心脑血管疾病的药理活性(专利公开号：cn101856357a)，同时具有降血脂等药理作用(专利公开号：cn101849950a)；另外，本发明人研究证明了救必应酸氨基酸衍生物具有抗肿瘤的作用(专利公开号：cn102391352b)；救必应酸酰化衍生物具有抗肿瘤的作用(专利公开号：cn102127142b)；本发明人还研究证明了救必应酸与丁二酸酐反应生成的衍生物具有防治心血管疾病的作用(专利公开号：cn102140126b)。这些救必应酸衍生物相对救必应酸母体本身，虽对肿瘤细胞抗癌活性有一定的提高，但未涉及对正常细胞毒性及其在抗肿瘤转移方面的研究；本课题组在前期研究的基础上发现了乙烷-1,2-双救必应酸酯跟救必应酸对比，其对不同种类肿瘤细胞均具有更显著的增殖抑制作用，且对正常细胞毒性较低，提示其具有安全、高效和低毒的特点，可望将其应用于肿瘤转移的早期预防和治疗中。鉴于此，以乙烷-1,2-双救必应酸酯为研究对象，探讨其在预防和治疗肿瘤转移方面的应用。
发明者合成的乙烷-1,2-双救必应酸酯其主要优势在于：乙烷-1,2-双救必应酸酯对肿瘤细胞的抗癌活性明显优于救必应酸母体，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移候选药物。因此，发明者将乙烷-1,2-双救必应酸酯应用于预防和治疗肿瘤转移药物研究，并通过体内外实验探讨乙烷-1,2-双救必应酸酯预防和治疗肿瘤转移的作用及机制。
在本发明完成之前，除本发明人研究外，还没有文献报道救必应酸的衍生物具有预防和治疗肿瘤转移的作用，也未发现乙烷-1,2-双救必应酸酯在制备预防和治疗肿瘤转移药物应用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种乙烷-1,2-双救必应酸酯在预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。为预防肿瘤转移和降低因肿瘤的转移造成的死亡率提供一个新的方向。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：
一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的乙烷-1,2-双救必应酸酯，其结构式如下：
如上所述的一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的乙烷-1,2-双救必应酸酯由以下方法得到：
1、乙醇提取中药救必应(ilicisroutundaecortex)，经纯化、分离、碱降解而获得的救必应酸(rotundicacid)。
2、取救必应酸2mmol，置圆底烧瓶中，溶于dmf20ml中，加入无水碳酸钾4mmol，室温搅拌30分钟，加入1,2-二溴乙烷4mmol，回流反应，tlc检测反应至终点，回收溶剂，乙酸乙酯150ml溶解，用水，饱和食盐水分别洗涤3次，每次50ml，取乙酸乙酯液，无水硫酸钠脱水，过滤，回收溶剂，蒸干，干燥，以石油醚-乙酸乙酯＝1:1为展开剂进行硅胶柱分离，合并，回收溶剂，干燥即得乙烷-1,2-双救必应酸酯(ethane-1,2-bis-rotundicacidester)。
乙烷-1,2-双救必应酸酯实验数据为：分子量：1003.44，白色粉末，分子式为c62h98o10；1hnmr(400mhz，dmso)δ:5.21(2h，12-ch)，4.22-4.19(4h，19-oh，3-oh)，3.85(2h，23-oh)，3.63(q，j＝5.4hz，4h，1'-ch2，2'-ch2)，3.47-3.41(2h，3-ch)，3.33(d，j＝10.5hz，2h，23-ch2)，3.07(d，j＝10.5hz，2h，23-ch2)，2.64-2.54(2h，11-ch2)，2.41(2h，18-ch)，1.98-1.79(4h)，1.66-1.45(24h)，1.30(6h，30-ch3)，1.25-1.14(10h)，1.09(6h，27-ch3)，0.96-0.94(2h)，0.87(6h，24-ch3)，0.85(d，j＝6.6hz，6h，29-ch3)，0.64(6h，26-ch3)，0.54(3h，25-ch3)；13cnmr(100mhz，dmso)δ：176.70(c-28)，138.16(c-13)，127.54(c-12)，71.72(c-03)，70.67(c-19)，64.86(c-23)，63.75(c-18)，53.41(c-05)，47.75(c-09)，46.78(c-17)，46.67(c-20)，41.91(c-14)，41.46(c-08)，41.19(c-01)，38.14(c-04)，37.24(c-22)，36.32(c-10)，32.33(c-07)，30.87(c-1')，28.12(c-15)，26.65(c-21)，26.40(c-29)，25.88(c-02)，25.18(c-16)，24.12(c-27)，23.26(c-11)，17.68(c-06)，16.58(c-25)，16.24(c-26)，15.53(c-30)，12.63(c-24)。因为结构对称，所以解析和谱图显示的是一半的结构。
上述所述乙烷-1,2-双救必应酸酯具有预防和治疗肿瘤转移作用中，肿瘤包括但不限于肝癌、黑色素瘤。
以上所述的一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的乙烷-1,2-双救必应酸酯，可用于制备在预防和治疗肿瘤转移的药物。可与药学上可接受的载体共同制成各种剂型：散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、粉针、乳剂、脂质体、混悬剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、气溶胶、粉雾剂、贴剂、栓剂、滴剂或滴丸剂，在治疗上也可通过各种给药方式实现：口服给药、注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药、腔道给药等。
本发明的特点为：对从救必应中提取的救必应酸为先导化合物进行化学修饰，得到乙烷-1,2-双救必应酸酯，经药理实验证明，具有对肿瘤细胞的转移具有明显的抑制作用，且活性明显优于母体化合物救必应酸。也是首次将乙烷-1,2-双救必应酸酯用于预防和治疗肿瘤转移方面的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)乙烷-1,2-双救必应酸酯对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移药。
(2)乙烷-1,2-双救必应酸酯能抑制肿瘤细胞对细胞外基质及人脐静脉内皮细胞(huvec)的粘附。
(3)乙烷-1,2-双救必应酸酯能抑制肿瘤细胞的运动迁移能力。
(4)乙烷-1,2-双救必应酸酯能防治小鼠b16-f10黑色素瘤发生
肺部转移。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌细胞hepg2的增殖抑制及对正常肝细胞lo2毒性的研究
将处于对数生长期肝癌细胞hepg2和人正常肝细胞lo2消化后，细胞密度调整为1×105个/ml，接种于96孔板，每孔100μl，置37℃，5％co2培养箱中培养24h；移去旧的培养基，加入受试药物(救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯)用培养基将受试药物存储液稀释，设定不同的浓度，每孔100μl，另设空白对照组，每组设5个复孔。药物作用24h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清无酚红培养基100μl，再加入0.5mg/mlmtt的溶液100μl，继续孵育4h后，终止培养；吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μldsmo，振荡10min，于570nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(od值)，计算细胞成活率(％)＝(用药组平均od值/空白对照组平均od值)×100％。实验结果见表1。
表1救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对hepg2的增殖抑制及对lo2毒性实验结果
实验结果表明乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌细胞hepg2具有显著的抑制增殖作用，且具有剂量依懒性，而救必应酸效果不明显；低浓度的(0.25-5μm)乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌细胞hepg2作用24h后的具有一定的增殖抑制作用，其抑制率为10.5％-66.2％；该浓度范围的lo2细胞的存活率均大于92％，对正常肝细胞lo2毒性较小。在0.25-10μm浓度范围内，乙烷-1,2-双救必应酸酯的抗癌活性明显高于救必应酸本身，且乙烷-1,2-双救必应酸酯较救必应酸对正常细胞的毒性更低，兼具安全低毒的特点。
实施例2
救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯抑制肝癌细胞hepg2对细胞外基质的粘附作用
将保存于-20℃的纤粘蛋白fn(fibronectin)静置于37℃水浴至完全融解，用无血清培养液，配置成为浓度为10μg/ml的fn工作液。使用100μl/孔fn工作液完全覆盖于96孔板，室温放置过夜，轻轻吸去液体。取对数生长期hepg2细胞，制成单细胞悬液，细胞浓度为5×105/ml，与不同浓度的药物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μm)混合，接种于fn包被的96孔板中。37℃，5％co2孵育2h后，pbs轻洗3遍，控干后加入mtt的培养液10μl，继续孵育4h，弃上清，加入100μldmso，溶解后使用酶联检测仪检测570nm处的od值。
粘附抑制率(％)＝(1-用药组平均od值/空白对照组平均od值)×100％。
表2救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯抑制肝癌细胞hepg2对细胞外基质的粘附作用
结果显示乙烷-1,2-双救必应酸酯能明显抑制人肝癌细胞hepg2对fn胶的粘附能力，抑制率为5.9％-56.9％，具有剂量依赖性；而救必应酸仅5μm组的抑制效果(16.5％)与对照组比较存在显著性差异。
实施例3
救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯抑制肝癌细胞hepg2与huvec细胞的粘附实验
人脐静脉内皮细胞分离自正常妊辰分娩的脐带静脉，进行培养。将处于对数期的huvec细胞消化后接种于24孔板，待上述24孔板的内皮细胞长满孔板时，用pbs清洗两三次，然后加入含有内皮刺激因子il-1β，浓度为1ng/l的培养基，在37℃，5％co2的条件下孵育4h。4h后取出孔板，用pbs清洗两三次后，取对数生长期hepg2细胞，荧光标记后制成4×105/ml-1单细胞悬液，并加入不同浓度本发明衍生物的rpm-1640培养液，药物终浓度分别为：0、0.25、0.2、1.0、2.5、5.0μm，每孔500μl。37℃、5％co2孵育2h后，pbs轻洗3遍，控干后加入无血清培养液500μl。然后在荧光显微镜下进行拍照，随机拍取10个视眼后并记录每个视眼的细胞数，计算不同浓度的救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对内皮细胞粘附抑制率。
粘附抑制率(％)＝(1-用药组平均细胞数/空白对照组平均细胞数)×100％。
表3救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯抑制肝癌细胞hepg2与huvec细胞的粘附实验
由表3可知，与对照组比较，0.25-5μm的乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌hepg2细胞与huvec细胞的粘附的抑制率分别为12.8％，22.9％、37.8％、53.8％、64.8％。而0.25-5μm的救必应酸对肝癌细胞hepg2与huvec细胞粘附的抑制作用不明显；5μm的救必应酸对肝癌细胞hepg2与huvec细胞粘附的抑制率仅为15.7％。
实施例4
救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对人肝癌细胞hepg2迁移的影响
选取对数生长期的hepg2细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为2×105/ml，以2ml/孔接种于6孔板中，置于37℃，5％co2的培养箱中培养12h，细胞单层铺满孔板时；pbs轻洗3遍，分别加入救必应酸和衍生物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μm)测定距离，培养24h后，测定迁移距离。实验重复三次计算细胞迁移抑制率。
细胞迁移抑制率＝[1-(用药组0h平均距离-用药组24h平均距离)/(对照组0h平均距离-对照组24h平均距离)]×100％
表4救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对人肝癌细胞hepg2迁移的影响
实验结果结果表明：与对照组相比，5μm的救必应酸对肝癌细胞的迁移抑制率为15.6％，对肝癌细胞hepg2的迁移抑制作用不明显。不同浓度的乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌细胞hepg2的迁移抑制作用具有剂量依赖性，随着浓度的增加，hepg2细胞的迁移率显著降低；5μm的乙烷-1,2-双救必应酸酯对肝癌hepg2细胞作用24h后，细胞的迁移抑制率高达63.8％。
实例5
救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对小鼠黑色素瘤b16-f10细胞人工肺转移瘤形成的抑制作用
取生长期b16-f10细胞，pbs缓冲液调整细胞浓度至1×10个ml-1。c57/bl6小鼠尾静脉注射，每只0.2ml。随机分为生理盐水组、实验组共5组，每组8只。对照组给予生理盐水，乙烷-1,2-双救必应酸酯分为低中高三个剂量组，给药剂量为10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1，救必应酸(40mg·kg-1)组。肿瘤接种后次日采用灌胃方式给药，每只一次给药0.2ml，每天1次，连续给药21d。于给药结束后次日脱颈椎处死小鼠，取肺，福尔马林固定液固定，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶数，按下式计算抑制率。
抑制率＝(1-给药组平均转移瘤灶数/生理盐水组平均转移瘤灶数)×100
表5救必应酸及乙烷-1,2-双救必应酸酯对小鼠黑色素瘤b16-f10细胞人工肺转移瘤形成的抑制作用
实验结果表明，不同剂量的乙烷-1,2-双救必应酸酯给药后，与空白对照组比较，可以不同程度的抑制肺转移灶的形成；乙烷-1,2-双救必应酸酯高剂量用药组对b16-f10细胞的肺转移抑制率高达70.4％；而同剂量组的救必应酸用药组，抑制率仅为23.5％，细胞的肺转移无明显的抑制作用。