本发明涉及一种青蚶线粒体cytochromecoxidasesubuniti(coi)基因扩增引物的筛选方法，属于渔业相关的基因生物信息分析学领域。
背景技术：
青蚶(barbatiavirescens)隶属于软体动物门(mollusca)、双壳纲(bivalvia)、列齿目(taxodonta)、蚶科(arcidae)、须蚶属(barbatia)，主要分布于我国浙江嵊山以南至海南沿海，日本、越南、菲律宾等国也有分布。青蚶主要栖息于潮间带到数十米深的浅水区，以足丝附着于岩礁缝隙中。青蚶作为蚶科贝类中的经济品种，肉味鲜美、营养丰富，具有较大的养殖开发潜力。青蚶作为沿海生态系统中的滤食性物种，在海岸生态系统的综合功能中具有重要作用，同时也是我国重要的渔业资源之一。
然而，由于我国近年来不断增长的海产品需求，导致过度捕捞和栖息地被破坏，青蚶的自然资源量持续下降，野生种群已难以采集。因此，对青蚶的自然资源的保护，以及对其遗传多样性和遗传结构的研究迫在眉睫。目前对于青蚶的研究相对较少，仅在青蚶的人工育苗、精子超微结构、血红蛋白亚基结构等方面有报道，基于分子标记的遗传多样性的研究还未见报道，这种现状极大的阻碍了对青蚶种质资源的开发利用和保护。
线粒体脱氧核糖核酸(mitochondrialdna，即mtdna)因其单亲遗传、进化速度快、核苷酸替代率高、分子量小，已作为一种重要的分子标记，广泛应用于群体遗传学和系统发生的研究中。其中，线粒体细胞色素c氧化酶i（cytochromecoxidasesubuniti,coi）基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用。folmer等(1994)设计的coi基因扩增引物（coil-1490和coih-2198）是目前在无脊椎动物中广泛使用的通用引物。然而，该通用引物在青蚶群体中扩增效率低，大部分个体无法获得扩增产物。
因此，开发适用性好、扩增效率高的青蚶coi基因扩增引物将为青蚶种质资源的保护和利用以及遗传多样性评估奠定重要基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种青蚶线粒体coi基因扩增引物，另一目的是提供该引物的筛选方法，以弥补现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种青蚶线粒体coi基因扩增引物，该引物序列为：
coiq-f：5’-tcatattcggctaaatctt-3’，
coiq-r：5’-catctttccacacctcaa-3’。
上述青蚶线粒体coi基因扩增引物的筛选方法，包括以下步骤：
1、下载已有的青蚶线粒体coi序列；
2、将下载的青蚶线粒体coi序列比对分析，确定序列两端保守区域；
3、在确定的保守区域设计多对引物，并进行合成；
4、提取青蚶dna，分别与合成的多对引物在反应体系下进行pcr反应；
5、琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率最高的一对引物coiq-f和coiq-r：
coiq-f为5’-tcatattcggctaaatctt-3’，
coiq-r为5’-catctttccacacctcaa-3’。
进一步的，上述步骤1中通过登陆美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的dna序列数据库（genbank）进行青蚶线粒体coi序列的下载。
进一步的，上述步骤2中利用mega6.0软件进行对比。
进一步的，上述步骤3中利用引物设计软件primerpremier5。
进一步的，上述步骤4中反应体系为：100ng模板dna，0.25utaq聚合酶，1×pcrbuffer，0.2mmdntps，1.5mmmgcl2，引物各1μm。pcr扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，48℃退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
本发明的优点和技术效果：
本发明筛选出一对用于扩增青蚶线粒体部分coi基因序列的引物coiq-f和coiq-r，并确定了其反应体系和pcr扩增条件，经检测证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，且其扩增效率高达94％，能够满足青蚶遗传多样性分析的需要。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。
本实施例选用50例青蚶，福建霞浦28例，广东阳江22例。
本实施例通过以下步骤筛选青蚶线粒体coi基因的扩增引物：
1、登陆美国国家生物技术信息中心(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载已有的12条青蚶线粒体coi序列(genbank登录号为：kj774469，ku341920-341927，hq258840-258841)。
2、用序列处理软件mega6.0对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端比较保守的区域。
3、经比对后，在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件primerpremier5设计引物。设计的多对引物交由上海生工生物技术有限公司合成。
4、用苯酚-氯仿法对两个野生群体的青蚶共50个个体进行dna提取，经检测dna无明显降解，后加稀释为100ng/μl的工作液备用。
5、在10μlpcr反应体系中用合成的多对引物分别扩增50个青蚶个体的coi基因片段，该体系为：100ng模板dna，0.25utaq聚合酶(takara)，1×pcrbuffer，0.2mmdntps，1.5mmmgcl2，引物各1μm。pcr扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，48℃退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
扩增出的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的一对引物coiq-f和coiq-r。该引物的coi基因扩增产物片段长度约600bp，50个个体中47个个体成功扩增，明亮条带，扩增效率为94％。
再利用abiprism3130测序仪(appliedbiosystems)双向测序。测序所得序列用seqman软件拼接，与已有的12条青蚶coi序列进行多重比对分析，确定所得序列为青蚶线粒体coi基因序列：
coiq-f为5’-tcatattcggctaaatctt-3’，
coiq-r为5’-catctttccacacctcaa-3’。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化和改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
sequencelisting
<110>中国海洋大学
<120>一种青蚶线粒体coi基因的扩增引物
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>coiq-f
<400>1
tcatattcggctaaatctt19
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>coiq-r
<400>2
catctttccacacctcaa18