本发明涉及一株产γ-癸内酯的滴孔菌及其在制备γ-癸内酯中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
内酯类香料以其独特的香气品质在香料行业中占有重要位置，可用于食品和日用品香精的调配。其中，应用较为广泛的一种是γ-癸内酯。γ-癸内酯(gamma-decalactone，gdl)，又称为丙位癸内酯，其分子式为c10h18o2，γ-癸内酯的香气阈值为11μg/kg，香气阈值很低，香气很强，具有甜果香、桃子、椰子、香草以及奶油香气的味道。γ-癸内酯被美国食品和药物管理局将其列为一般公认为安全的食品添加剂。中国食品添加剂使用卫生标准也将其列为允许使用的食品用香料。γ-癸内酯是调配牛奶、奶油、黄油、桃子、杏子、浆果、芒果、苹果、草莓、椰子、柑橘、巧克力等食用香精的常用原料。
天然γ-癸内酯存在于很多水果中，如桃子、草莓、椰子、芒果、杏子等。从这些天然原料中提取是制备天然γ-癸内酯的主要方法。但是由于植物原料的生产受地域和季节限制，难以实现持续和大量的供应。目前γ-癸内酯的主要生产方法是化学合成。然而合成香料生产过程中残留的化学物质可能对人体健康带来不利，而且化学合成法合成的γ-癸内酯是无旋光的外消旋混合物，而利用微生物生产则可以得到具有旋光活性和较纯的产物，是天然香料生产的大趋势。
目前发现能够合成或转化产生γ-癸内酯的微生物主要为酵母菌和部分丝状真菌，其中研究最多的为耶罗威亚解脂酵母yarrowialipolytic，该菌种及利用该菌种发酵产生γ-癸内酯的技术已获得国外专利的保护。
γ-癸内酯是多种微生物代谢的中间产物，以蓖麻油为前体利用微生物发酵可以产生γ-癸内酯。但是，根据目前有关微生物产生γ-癸内酯的文献，多数报道是有关γ-癸内酯的代谢途径理论方面的研究，少数涉及的γ-癸内酯的生产的报道也是菌种经过基因工程操作的突变菌株才能达到克级的生产能力。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产γ-癸内酯的滴孔菌及其在制备γ-癸内酯中的应用。利用本发明所述菌株可有效地转化蓖麻油生成γ-癸内酯，实现通过微生物发酵法获得以γ-癸内酯为主要目的产物的愿望。
本发明所述产γ-癸内酯的滴孔菌a-9属于多孔菌科滴孔菌属，其特征在于：该菌株名为滴孔菌(piptoporussp.)a-9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccn0.13895。
上述产γ-癸内酯及三萜类化合物的滴孔菌a-9是一株发明人自主野外采摘分离纯化得到的滴孔菌，其生物学特征是：子实体无柄，呈现半圆形，大小约20×15cm，单片菌盖厚度约0.5-1.5cm，菌盖覆瓦状排列。子实体正面呈现淡黄色至橙色，边缘颜色较深，呈现波浪状或瓣状，较圆滑，子实体背面呈现白色，边缘黄色，布满菌孔。菌丝系统二体型，具有生殖菌丝和骨架菌丝。生殖菌丝具有担子菌菌丝的显著特点，即锁状联合。同时该菌生殖菌丝还具有简单隔膜，但是简单隔膜的数量较少，且往往出现于菌丝的前端。生殖菌丝的直径从2-3μm到5-7μm不等。
对本发明所述产γ-癸内酯的滴孔菌a-9cgmccn0.13895测定18srrna以及its的基因序列的结果显示，其18srdna序列长度为1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其its序列片段大小为727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。通过形态观察和18srrna以及its的基因序列比对，初步鉴定为piptoporussp.。
本发明所述产γ-癸内酯的滴孔菌a-9菌种选育的基本方法是：
菌种系采自于野外的担子菌子实体。将新鲜的子实体以无菌手术刀切开，用眼科镊子撕取少许菌肉接种于pda平板，30℃培养。待菌丝垫直径达2-3厘米时，从菌丝边缘挑取少许菌丝接种于新的pda平板，经反复多次转接，直至分离得到纯菌种。将该菌株命名为滴孔菌(piptoporussp.)a-9，该菌株已于2017年5月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccn0.13895。
本发明所述的产γ-癸内酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在制备γ-癸内酯中的应用。
其中，所述应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，27～33℃条件下，静止培养96～102小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100ml液体种子培养基中，置旋转转速为160～180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，27～33℃培养72～96小时，得种子液；
(4)以γ-癸内酯为目的产物发酵培养
摇瓶发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80～100ml(500ml三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，27～33℃，转速为150～180转/分钟，ph为5.0±0.5，摇瓶发酵144～168小时，即获得含γ-癸内酯的发酵产物；
或者，5l发酵罐发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有3.3～3.5l发酵培养基的5l发酵罐中，27～33℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为200～300r/min，通气量8l/min，罐内压力1.0±0.02mpa，发酵时间为144～168小时，发酵液初始ph值为5.0～6.0，发酵过程中定时取样测定发酵液中的菌体干重和γ-癸内酯的浓度，当发酵液中γ-癸内酯浓度不再上升时，结束发酵，即获得含γ-癸内酯的发酵产物；
其中：上述斜面培养基组成为：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然；固体培养基加1.5％琼脂粉，即pda；
上述液体种子培养基组成：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然；
上述以γ-癸内酯为目的产物发酵培养基的组成是：可溶性淀粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐温-20体积比0.05％，七水合硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.46g/l，十二水合磷酸氢二钠1.2g/l；去离子水1l，ph5±0.5，灭菌117℃，30min。
上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选30℃。
上述的应用中，步骤(2)所述培养时间优选100小时。
上述的应用中，步骤(3)所述培养时间优选80小时。
上述的应用中，步骤(4)所述培养时间优选150～160小时。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵培养基初始可溶性淀粉浓度优选20g/l～30g/l。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵培养基的ph优选为5.0。
上述γ-癸内酯按下述方法测定：
气相色谱检测：标准样品制备：取6.33μlγ-癸内酯标准样品加入到3ml色谱纯乙酸丁酯中，即得到浓度为2g/l的γ-癸内酯标准样品，以此样品稀释得到浓度分别为1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的标准样品。
gc分析条件：
进样口spl1：温度250℃，压力：23mpa，控制方式线速度，线速度10.3cm/min，总流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹扫流量2ml/min，分流比20:1，进样体积1μl。
柱温：起始温度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。
检测器：氢火焰离子检测器fid，检测器温度275℃，氢气流量40ml/min，空气流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。
载气：高纯氮气
取样时取1ml培养物于5ml离心管中，加入1ml分析纯乙酸丁酯，充分振荡混匀，离心12000rpm，10min，取上层有机相0.8ml于1.5ml离心管中，离心12000rpm，10min，离心完毕以无菌注射器取适量以0.22μm有机系滤器过滤，进行气相色谱检测。
本发明公开了一株产γ-癸内酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9，作为自主采摘分离鉴定的新菌株，发明人未检索到有关利用滴孔菌a-9以生产γ-癸内酯为目的产物的文献报道，也未检索到滴孔菌属其他菌种产γ-癸内酯或与cgmccn0.13895菌株有相当的高产率的文献报道。实验证实利用本发明所述滴孔菌cgmccn0.13895可发酵转化蓖麻油直接生成并获得目的产物γ-癸内酯，蓖麻油转化生成γ-癸内酯的转化率高，菌种发酵性能稳定，是一株极具研究开发价值的γ-癸内酯生产菌株。其为液体发酵生产γ-癸内酯探索了新的方向与途径，为将来进行发酵生产打下基础。
本发明采用生物发酵的方法，以可溶性淀粉、蔗糖、豆粕粉等为原料生产γ-癸内酯具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富，生产成本低等特点，发酵生产的γ-癸内酯产率最高可达6.5g/l以上，具有较高的应用价值，极具工业化应用前景。
具体实施方式
实施例1产γ-癸内酯的滴孔菌菌株分离纯化
菌种系采自于野外的担子菌子实体。将新鲜的子实体以无菌手术刀切开，用眼科镊子撕取少许菌肉接种于pda平板，30℃培养。待菌丝垫直径达2-3厘米时，从菌丝边缘挑取少许菌丝接种于新的pda平板，经反复多次转接，直至分离得到纯菌种。将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，得到一株性能稳定的γ-癸内酯产生菌，该菌株命名为滴孔菌(piptoporussp.)a-9。
上述菌株滴孔菌a-9已于2017年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为cgmccn0.13895。
上述液体种子培养基组成(g/l)：铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然。
上述斜面培养基组成为(g/l)：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然。固体培养基加1.5％琼脂粉，即pda。
上述发酵培养基的组成(g/l)：可溶性淀粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐温-200.05％(体积比)，硫酸镁(七水合)0.5g/l，磷酸二氢钾0.46g/l，磷酸氢二钠(十二水合)1.2g/l。去离子水1l，ph5，灭菌117℃，30min。
实施例2滴孔菌a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列测序
将实施例1分离纯化得到的产γ-癸内酯菌株即cgmccno.1869菌株委托博尚生物公司进行18srdna测序。
实验方法是：挑取斜面培养物，提取基因组作为模板，分别以通用引物ns1，ns8扩增18srrna基因，片段大小约为1.8kb，以通用引物its1，its4扩增its序列，片段大小约为750bp。
取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切胶回收目的片断，对上述回收产物进行dna测序。
测序结果：
cgmccn0.13895菌株18srdna序列长度为1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；cgmccn0.13895菌株its序列片段大小为727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。
表1所用引物列表
实施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在摇瓶培养制备γ-癸内酯中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30℃条件下，静止培养100小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100ml(500ml三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为160转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30℃培养80小时，得种子液；
(4)摇瓶发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有90～100ml(500ml三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，30～35℃，转速为150～180转/分钟，摇瓶发酵150小时，即获得含γ-癸内酯的发酵产物；
上述斜面培养基组成为：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然。固体培养基加1.5％琼脂粉，即pda；
上述液体种子培养基组成：马铃薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然；
上述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉20g/l，豆粕粉30g/l，蓖麻油100g，吐温-20体积比0.05％，硫酸镁(七水合)0.5g/l，磷酸二氢钾0.46g/l，磷酸氢二钠(十二水合)1.2g/l，去离子水1l；ph5，灭菌117℃，30min。
(5)产物检测：取样时取1ml培养物于5ml离心管中，加入1ml分析纯乙酸丁酯，充分振荡混匀，离心12000rpm，10min，取上层有机相0.8ml于1.5ml离心管中，离心12000rpm，10min，离心完毕以无菌注射器取适量以0.22μm有机系滤器过滤，进行气相色谱检测；
经检测发酵液中γ-癸内酯的含量为3.6g/l。
实施例4滴孔菌a-9cgmccn0.13895在发酵罐培养制备γ-癸内酯中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用滴孔菌a-9(piptoporussp.)cgmccn0.13895；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，35℃条件下，静止培养102小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100ml(500ml三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，30～35℃培养80小时，得种子液；
(4)发酵培养：
5l发酵罐发酵：以8～10％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有3.5l发酵培养基的5l发酵罐中，30℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为250r/min，通气量以发酵液体8l/min，罐内压力0.08mpa；发酵液初始ph值为5.0～5.5，发酵过程中定时取样测定发酵液中γ-癸内酯的浓度，发酵时间为144小时，结束发酵，即获得含γ-癸内酯的发酵产物；
上述斜面培养基组成为：马铃薯220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然，固体培养基加1.5％琼脂粉，即pda；
上述液体种子培养基组成：马铃薯220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去离子水1l，将马铃薯去皮后切成小块，在水中煮沸30min，以8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖，补足水至1l，ph自然；
上述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉40g/l，豆粕粉40g/l，蓖麻油100g，吐温-20体积比0.05％，硫酸镁(七水合)0.5g/l，磷酸二氢钾0.46g/l，磷酸氢二钠(十二水合)1.2g/l。去离子水1l，ph5，灭菌117℃，30min。
(5)产物检测：取样时取1ml培养物于5ml离心管中，加入1ml分析纯乙酸丁酯，充分振荡混匀，离心12000rpm，10min，取上层有机相0.8ml于1.5ml离心管中，离心12000rpm，10min，离心完毕以无菌注射器取适量以0.22μm有机系滤器过滤，进行气相色谱检测；
经检测发酵液中γ-癸内酯的含量为6.8g/l。
上述实施例所述γ-癸内酯按下述方法测定：
气相色谱检测：标准样品制备：取6.33μlγ-癸内酯标准样品加入到3ml色谱纯乙酸丁酯中，即得到浓度为2g/l的γ-癸内酯标准样品，以此样品稀释得到浓度分别为1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的标准样品。
gc分析条件：
进样口spl1：温度250℃，压力：23mpa，控制方式线速度，线速度10.3cm/min，总流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹扫流量2ml/min，分流比20:1，进样体积1μl。
柱温：起始温度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。
检测器：氢火焰离子检测器fid，检测器温度275℃，氢气流量40ml/min，空气流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。
载气：高纯氮气
取样时取1ml培养物于5ml离心管中，加入1ml分析纯乙酸丁酯，充分振荡混匀，离心12000rpm，10min，取上层有机相0.8ml于1.5ml离心管中，离心12000rpm，10min，离心完毕以无菌注射器取适量以0.22μm有机系滤器过滤，进行气相色谱检测。
序列表
<110>山东大学
<120>一株产γ-癸内酯的滴孔菌及其应用
<141>2017-06-14
<160>2
<210>1
<211>1679
<212>rdna
<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9
<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列
<222>（1）…（1679）
<400>1
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<210>2
<211>727
<212>dna
<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9
<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的its序列
<222>（1）…（727）
<400>2
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