一种降解苯酚的盐单胞菌的制作方法

本发明涉及微生物及生物降解技术领域，具体地，涉及一种盐单胞菌及其在降解苯酚中的应用。

背景技术：

苯酚及其衍生物对人和动植物的毒性很强，已被列入环境优先控制污染物名单。含酚废水主要来源于造纸、炼油、合成纤维、合成橡胶、农药等行业，是工业排放废水中主要的污染物。在这些含酚废水中除了含苯酚类污染物之外，往往还含有大量盐分而使之成为高盐含酚废水，这类废水排放到环境中会对土壤、地表水和地下水造成严重污染。由于高盐环境对微生物生长具有抑制和毒害作用，使得常规的生物降解技术在处理这类废水时存在瓶颈问题。嗜盐菌能直接用于去除高盐工业废水中的有机污染物而无需先降低废水盐度，因而逐渐受到人们的广泛关注。

盐单胞菌(halomonastaeanensis)革兰氏阳性杆状，成单或双。有鞭毛，位置因菌种而异，周身或极端。有动力。在含盐8％的培养基上，菌落白色或奶酪色，光滑，直径小于2mm。兼性厌氧菌。还原硝酸盐为亚硝酸盐。触媒阳性。kovas氏氧化酶通常阳性，细胞色素氧化酶阴性。发酵葡萄糖产酸。可在含盐量达8％的培养基中生长，耐盐范围0-32％。适合ph5-9生长。生长温度：15-45c。目前有对盐单胞菌在正常条件下对污染物降解特性的研究，但是在高盐条件下对污染物降解的研究，尤其是对酚类物质的降解特性未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株能够降解苯酚的盐单胞菌。

本发明从盐湖淤泥中分离到一株能够降解苯酚的菌株。通过菌株形态学特征，生理生化特征和16srrna序列分析将该菌株鉴定为盐单胞菌，命名为h17，该菌株于2016年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072)，保藏编号为cctccno.m2016306，分类名为盐单胞菌halomonastaeanensis。

本发明提供了含有盐单胞菌h17的菌剂。

本发明提供了含有盐单胞菌h17的生物清洁剂。

本发明提供了盐单胞菌h17或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在清洁环境中的应用。

进一步，本发明提供了盐单胞菌h17或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在降解苯酚中的应用。

本发明提供了盐单胞菌h17或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在处理工业废水中的应用。

本发明提供了盐单胞菌h17或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在处理医用废水中的应用。

本发明提供了盐单胞菌h17在制备生物清洁剂中的应用。

本发明提供了盐单胞菌h17在制备生物降解剂中的应用。

所述生物降解剂为苯酚降解剂。

本发明的盐单胞菌h17能够在50h内，浓度5％-10％的环境下，可降解浓度为200mg/l苯酚达到90％以上，当氯化钠浓度达到15％时，对苯酚的降解率也可达到80％以上，表明该菌具有很好的抗盐效果。本发明提供的盐单胞菌h17及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于苯酚污染环境的生物修复或高盐环境下的苯酚的降解，可广泛应用于环境清洁领域，含苯酚的工业废水或医用废水处理领域，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为菌株h17与相近种16srdna序列进化树，通过菌株h17的16srrna序列比对分析，与其最相近的是泰安郡盐单胞菌(halomonastaeanensisbh539)，相似性为99％。

图2为菌株h17的生长及对苯酚降解的特性图。

图3为菌株h17在不同盐浓度下对苯酚的降解图。

图4为苯酚浓度的标准曲线(od270)。

图5为菌株h17在不同初始苯酚浓度中的生长及降解苯酚特性图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1盐单胞菌h17的分离和鉴定

1、盐单胞菌h17的分离

a、将采集到的固体样品(盐湖淤泥、海底淤泥、高盐废水处理污泥等)1-5g或500ml的液体样品(盐湖水、海水、高盐废水等)过滤物，溶于10-50ml液体培养基(10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl15％、蒸馏水添加至1000ml。调节ph为7.2左右，121℃灭菌15min)，室温下，转速80-160rpm振荡30-120分钟，取出静置20-40分钟，用移液器吸取100μl，均匀涂布在固体培养基的培养平板上(上述液体培养基加2％琼脂得)，置于28℃恒温培养箱中进行静置培养。

b、直到培长出可见菌落时，用接种环挑取单个菌落，在平板固体培养基表面上连续划线；

c、如此反复划线培养，直至获得纯培养嗜盐菌菌株。

d、挑取纯培养的单个菌落，转接于含有苯酚的液体培养基中，在28℃、150rpm的恒温摇床中进行培养，菌液至浑浊；

本步骤中的液体培养基1l配方为nacl100g、tris2g、kcl2g、kno31g、nh4cl5g、mgso4·7h2o24g、mnso4·h2o0.688g、cacl20.12g、葡萄糖1g，蒸馏水添加至1000ml。100ml上述液体培养基中加入灭过菌的0.05mol/lna2hpo42ml、0.01mol/lfeso42ml、10mg/ml酵母提取物2ml、10mg/ml胰蛋白胨2ml、10mg/ml苯酚2ml(换算后为200mg/l苯酚溶液)。

e、用移液器吸取200μl菌液转接于步骤d所述的含有苯酚的液体培养基中，如此反复5-8次，获得一株稳定高效的降解苯酚的嗜盐菌，命名为h17。

2、菌株的形态学特征

该菌菌落呈乳白色，圆形，隆起，表面湿润，比较光滑，菌落边缘很整齐，革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性杆菌。

3、16srdna鉴定

该菌株的16srdna部分序列长为1285bp，将该序列在ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blast比对分析，通过在genbank中进行blastn序列比对，挑选与菌株h17同源序列相似性最高的有代表性的菌株，采用邻位相接法(neighbor-joining)利用mega6.0软件构建系统进化树，见图1，自展检验(bootstrap)1000次。显示菌株h17为盐单胞菌，与目前已发表的盐单胞菌序列相似性达99％。

综合菌体形态、生理生化特性和16srdna基因序列，该菌株h17于2016年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072)，保藏编号为cctccno.m2016306，分类名为盐单胞菌halomonastaeanensis。

实施例2盐单胞菌h17的降解苯酚性能试验

采用高效液相色谱法检测盐单胞菌h17对培养基中苯酚降解作用。

1、菌株h17的生长及对苯酚降解的特性

菌株h17在苯酚浓度为200mg/l，氯化钠浓度为10％的培养基，所述培养基1l的配方为10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10％、蒸馏水添加至1000ml。调节ph为7.2左右，121℃灭菌15min。

中随时间变化菌株的生长与苯酚浓度变化曲线如图2所示。菌株h17在经过8h左右的停滞期后进入对数生长期，在此期间，菌株随时间几乎进行线性生长，接近30h及以后菌株处于稳定生长期。菌株对苯酚的降解主要在对数稳定期，菌株在此期间增殖能力强，对碳源需求大，苯酚降解速度快。此后，培养基中的碳源苯酚已相对较少，没有新的碳源补充，代谢产物也不断积累，菌株生长受到抑制，数量不再增加，此时菌株对苯酚降解达到最大，苯酚降解率为90％。

2、菌株h17在不同盐浓度下对苯酚的降解

一般微生物在处理高盐含苯酚废水时，由于废水中盐浓度会随着季节及水流量而变化，使其在处理上遇到瓶颈，这又考验微生物对变化的盐环境的适应性，增大了此类废水的处理难度。因此，盐浓度成为微生物降解苯酚的关键因素。

见图3，随着nacl浓度的增大，菌株的生长和对苯酚的降解是先升高后降低的趋势。当nacl浓度为10％时，菌株h17的对苯酚的降解达到最大，为90％；当nacl浓度大于15％时，菌株h17对苯酚的降解也可达到85％左右。

3、菌株在不同苯酚浓度下的降解特性研究

试验方法：将菌株分别接种到苯酚浓度为0mg/l，100mg/l，200mg/l，400mg/l，600mg/l，800mg/l的液体的培养基中(配方为10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10％、蒸馏水添加至1000ml)。调节ph保持在7.0，以165r/min的转速在温度为30℃的恒温摇床中进行培养，其他条件不变。测初始生物量和苯酚浓度以及在恒温摇床上培养72h后的生物量和苯酚浓度。

测定方法：吸取培养0h和60h后的培养液1ml，加入到5ml的离心管中，再向离心管中加入3ml的无菌培养液，稀释混匀后，使用紫外可见分光光度计检测其生物量od600。同时，吸取培养0h和60h后的培养液1ml，加入到1.5ml的离心管中，将其在6000r/min条件下离心10min，取上清液0.8ml加入到5ml的离心管中，再向离心管加入2.4ml无菌培养液，混匀后将紫外可见分光光度计波长设定为270nm，进行苯酚吸光度的测定，根据苯酚标准曲线(图4)计算苯酚初始浓度和60h浓度，从而计算苯酚降解率。

结果分析：通过数据分析可知，苯酚浓度的变化对菌株h17的生长和降解苯酚的能力有显著性影响(p<0.01)。由图5可知，菌株的生长和对苯酚的降解随苯酚浓度的变化有相似的规律，均随苯酚浓度的增大有先升高后降低的趋势。当苯酚浓度为200mg/l时，菌株h17的生长及对苯酚的降解均达到最大，其生物量od600为1.8，苯酚降解率为90％以上。通过多重比较可知，当苯酚浓度大于或小于200mg/l，菌株h17的生长和对苯酚的降解均显著变化(p<0.01)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。