一种具有抗肝癌活性的美蠊肽B及其应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b及其应用。
背景技术：
：目前，由于工业发展带来的环境污染等问题，人类的生存环境质量不断下降，肿瘤疾病的发病率和致死率也不断上升，严重威胁人们的健康和生活。癌症的发生与多种原因影响，例如环境污染、化学污染、电离辐射、自由基毒素或微生物及其代谢毒素等致癌物的影响，也可能受机体自身的影响，例如遗传特性、内分泌失衡、免疫功能紊乱等也会导致正常细胞发生癌变。国际抗癌联盟发布的数据，世界范围内癌症死亡比艾滋病、疟疾和结核病的总数还要多，如果不开发有效药物，癌症死亡人数将到2030年达到1700万。目前，世界范围内还没有开发出针对肝癌的特效药物，采取预防和治疗的手段，预防措施有定期体检，治疗一般临床上采用化疗，不仅患者痛苦而且康复情况也不乐观。虽然市场上一些抗癌药物，但是由于价格昂贵，副作用较强、疗效不明显等原因未能得到医药领域的广泛使用。美洲大蠊，俗称蟑螂，其应用于药物中最初是利用其抗菌特性，例如，蓝江林等人报道从美洲大蠊中提取分离的抗菌肽对大肠杆菌有抑菌作用[蓝江林,周先治,卓侃,等，美洲大蠊(periplanetaamericanal.)抗菌肽杀菌作用初步观察，福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33(2):166.]。近年来，随着人们对蟑螂进一步研究，发现蟑螂提取物具有抗肿瘤方面的应用，例如陈利铭等人报道蟑螂提取物at2在抗肿瘤作用中的研究，药理实验表明：at2具有抗肿瘤活性，能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，并能使脾脏重量增加，在体外可增加t淋巴细胞对cona的转化反应(陈利铭，蟑螂提取物at2抗癌作用的临床及实验研究，中西医结合杂志，1986，(11):648)。尽管现有技术中公开了蟑螂中存在有效抗癌的活性成分，但是成功分离纯化的抗癌活性成分种类较少，现有技术中大部分是研究美洲大蠊中活性物质的提取方法，例如用醇水混合溶剂提取美洲大蠊虫体具有抗肿瘤(cn101057872；zl200710067706.x；zl200810059054.x)和体外抗单纯疱疹病毒的功效(zl200810060885.9)；以及用滤孔小于5000道尔顿(即<5kda)的超滤膜进行分离，能得到新的抗单纯疱疹病毒和光谱抗菌活性部位(zl201210137422.4；zl201210137410.1)。这些提取物对进一步制备抗癌药物存在较大影响，例如提取物中的杂质容易引起超敏反应，限制了用药的途径，同时进一步分离纯化还会大大降低药物的疗效。因此，目前对美洲大蠊中单一成分的活性物质的研究不多，远远不能满足医药市场的需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b及其应用，不仅具有抗肝癌活性，而且还能够方便经济地以人工合成方式大量生产。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本发明还提供了所述的美蠊肽b在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。优选的，所述美蠊肽b通过抑制vegf蛋白的表达从而抑制血管生成和/或肿瘤生长、转移，达到抗肝癌的目的。优选的，药物的剂型为注射剂或冻干粉。优选的，所述注射剂包括美蠊肽b和药用辅料。优选的，所述注射剂中美蠊肽b的质量浓度为6.25～200μg/ml。优选的，所述注射剂中美蠊肽b的质量浓度为25～150μg/ml。优选的，所述药用辅料为质量浓度0.9％的氯化钠溶液。本发明提供了一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。所述美蠊肽b能有效抑制肝癌细胞hepg2的细胞增殖和迁移，并且抑制强度随着美蠊肽b的浓度增加而增大。与其他美洲大蠊提取物(醇提物脱脂膏和大孔树脂60％醇水洗脱部位cⅱ-3)相比，美蠊肽b抑制hepg2增殖的作用具有明显的优势；与沙利度胺阳性对照相比，美蠊肽b具有相同或相似的抗肝癌作用。本发明提供的美蠊肽b为多肽，能够方便经济地以人工合成方式大量生产，从而摆脱活性物质来源的限制，能够满足市场和生产的需求。本发明提供的所述的美蠊肽b在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。本发明提供的应用没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、长期稳定，机体无排除反应等优点。附图说明图1为实施例3中美蠊肽b对hepg2划痕愈合率情况；图2为对比例3中cⅱ-3对hepg2划痕愈合率情况；图3为对比例4中脱脂膏对hepg2划痕愈合率情况。具体实施方式本发明提供了一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本发明中，所述具有抗肝癌活性的美蠊肽b的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的多肽合成方法即可。本发明实施例中，所述美蠊肽b的来源委托生工生物工程(上海)股份有限公司按照seqidno.1所示的氨基酸序列合成。本发明还提供了所述的美蠊肽b在制备预防或治疗抗肝癌的药物中的应用。本发明中，所述美蠊肽b抗肝癌的机理：通过抑制vegf蛋白的表达从而抑制血管生成和/或肿瘤生长、转移，达到抗肝癌的目的。本发明中，药物的剂型优选为注射剂或冻干粉。本发明中，所述注射剂优选包括美蠊肽b和药用辅料。本发明中，所述注射剂中美蠊肽b的质量浓度优选为6.25～200μg/ml，更优选为25～150μg/ml，最优选为50μg/ml。本发明中，所述药用辅料优选为质量浓度的0.9％的氯化钠溶液。本发明中，所述注射剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的注射剂的制备方法即可。本发明中，所述注射剂的注射剂量为250～2000ml/d，更优选为500ml/d。所述注射剂的注射间隔时间优选为6～36h，更优选为24h。本发明中，所述冻干粉使用时，优选配置成的注射液中美蠊肽b的质量浓度优选为6.25～150μg/ml，更优选为25～100μg/ml，最优选为50μg/ml。下面结合实施例对本发明提供的一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1美蠊肽b是存在于美洲大蠊药材中。所述美蠊肽b的提取方法包括以下步骤：将美洲大蠊药材经溶剂提取后，再经大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶柱层析、高效液相色谱技术等反复提取分离后，得到含有美蠊肽b的样品。委托生工生物(上海)公司制备美蠊肽b，用于药效学评价试验。所述美蠊肽b的理化性质如下：氨基酸残基个数:81字符:ddlrgdnd3字符:asp-asp-leu-arg-gly-asp-asn-asp分子量:918.87g/mol等电点:3.4ph＝7时的净电荷:-3.0平均亲水性:1.7亲水残基比例:75％将美蠊肽b的氨基酸序列送入ncbi数据库进行相关性比对检索鉴定。ncbiblast在线序列比对软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)搜索比对结果显示：与美蠊肽b最近似的为一个假设的氨基酸序列(hypotheticalproteinpgtg_10243)，且最高得分(score)＝26.5，而最小期望值(evalve)＝133；结果显示数据库中并没有与美蠊肽b同源性高的多肽或蛋白质，即没有检索到与之相匹配的多肽，显示美蠊肽b应该为一种未报道的新多肽。得到的多肽经过注射用水配置成浓度为1mg/ml的母液，保存于4℃环境中，实验时用培养基将药物母液稀释到所需浓度即可。实施例21、人肝癌hepg2细胞株的细胞培养人肝癌hepg2细胞株采用含10％的胎牛血清的高糖dmem完全培养基，置于5％co2、37℃培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。2、mtt法检测用药后人肝癌细胞hepg2细胞存活率hepg2细胞种板(1×105ml-1，100μl)接种于96孔板，培养24h。配置成浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、150μg/ml的美蠊肽b溶液，用上述6个浓度的美蠊肽b溶液进行干预，每个浓度设6个复孔，每孔200μl，同时设置沙利度胺(浓度为100μg/ml，200μg/ml)阳性对照组和空白对照组，继续培养24h。用酶联免疫检测仪在490nm检测各孔吸光度值a。按下式计算细胞抑制率。细胞抑制率ir(％)＝[1-a加药组/a空白对照组]×100％。3、统计学分析数据处理采用spss17.0统计软件和originpro8.6作图软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析；p<0.05为差异有统计学意义。对比例1以美洲大蠊cⅱ-3(即美洲大蠊醇提物经大孔树脂吸附、60％乙醇水洗脱的活性部位，黄褐色冻干粉末)(大理大学刘光明教授提供)替换实施例2中的美蠊肽b溶液，将cⅱ-3浓度设置为低、中、高剂量组(25、50、100μg/ml)，按照实施例2的方法处理hepg2细胞，计算抑制率。对比例2以美洲大蠊脱脂膏(即美洲大蠊醇提物经高温脱脂而得，褐色粘稠膏状)(大理大学刘光明教授提供)替换实施例2中的美蠊肽b溶液，将脱脂膏浓度设置为低、中、高剂量组(25、50、100μg/ml)，按照实施例2的方法处理hepg2细胞，计算抑制率。实施例2、对比例1和对比文件2的抑制率结果见表1。表1美蠊肽b以及阳性对照对hepg2细胞增殖的影响(n＝3)各组培养24、48和72h的细胞抑制率比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点测量的抑制率比较，差异有统计学意义(f＝4247.101，p＝0.000)；②不同药物处理后的抑制率比较，差异有统计学意义(f＝2460.773，p＝0.000)；③各组的细胞抑制率变化趋势有差异(f＝85.030，p＝0.000)。从用药浓度看，同一时间段的美蠊肽b、cⅱ-3、脱脂膏对hepg2细胞增殖的抑制率呈浓度依赖性。100μg/ml和200μg/ml的沙利度胺对hepg2细胞的增殖抑制率亦呈时间依赖关系，其中以72h抑制率为最高。各药之间作用比较，美蠊肽b抑制hepg2增殖的作用优于脱脂膏和cⅱ-3，相较于脱脂膏，美蠊肽b抑制率最高提高了42.20％，相较于cⅱ-3，美蠊肽b抑制率最高提高了69.80％。实施例3细胞划痕实验检测美蠊肽b对hepg2细胞的迁移抑制情况实验分组：空白对照组、沙利度胺对照组(浓度为100μg/ml，200μg/ml)、美蠊肽b浓度设置为低、中、高剂量组(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)。hepg2细胞常规消化，按密度为2×105ml-1接种于6孔板，每孔2ml。培养24h后，用200μl枪头在6孔板底部划一条直线，pbs洗涤2～3次，按实验分组加入药物。分别对0h，24h的划痕进行拍照，并测量划痕宽度。以上实验重复三次，取平均值计算划痕愈合率。划痕愈合率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。数据处理采用spss17.0统计软件和originpro8.6作图软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析；p<0.05为差异有统计学意义。对比例3以美洲大蠊cⅱ-3(黄褐色冻干粉末)替换实施例3中的美蠊肽b溶液，将cⅱ-3浓度设置为低、中、高剂量组(37.5、75、150μg/ml)，按照实施例3的方法处理hepg2细胞，计算愈合率。对比例4以美洲大蠊脱脂膏替换实施例3中的美蠊肽b溶液，将脱脂膏浓度设置为低、中、高剂量组(37.5、75、150μg/ml)，按照实施例3的方法处理hepg2细胞，计算愈合率。实施例3、对比例3和对比文件4的细胞迁移的影响见表2。表2美蠊肽b及对比例3和对比例4对hepg2细胞迁移的影响(n＝3)注：与对照组相比，ap<0.05；与沙利度胺相比，bp<0.05；与其低剂量组相比，cp<0.05；与其中剂量组相比，dp<0.05。实施例3、对比例3和对比文件4的划痕愈合率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义(f＝433.771，p＝0.000)。与对照组、沙利度胺组比较，经过美蠊肽b、cⅱ-3、脱脂膏处理后，hepg2细胞的划痕愈合率降低，并且随着浓度的增加，划痕愈合率逐渐减小，抑制细胞迁移具有浓度依赖性(见表2)。划痕24h后，各组hepg2细胞发生了明显迁移，划痕区域与0h相比明显变窄，说明细胞hepg2细胞在划痕后能自动愈合。然而，在经过不同剂量的美蠊肽b、cⅱ-3、脱脂膏和200μg/ml沙利度胺干预24h后，hepg2细胞的迁移距离均明显减小，划痕愈合率逐渐减小。美蠊肽b的愈合率相比对照组，愈合率降低了38.99％，而cⅱ-3相比对照组愈合率降低了18.22％，美蠊肽b较于cⅱ-3愈合抑制率高于214％。实施例4elisa实验检测美洲大蠊提取物对细胞中vegf蛋白表达的影响hepg2细胞常规消化，以1×105个/ml的密度接种于96孔板，37℃培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，按实施例3的实验分组方法加入不同浓度的美蠊肽b溶液，每个浓度设置3个复孔，每孔200μl。同时设置空白对照组和阳性对照组。分别培养24h和48h后收集细胞上清，3000rpm离心15min，取上清，保存于-20℃备用。按照elisa试剂盒说明书(深圳欣博盛生物科技有限公司)进行试验，酶标仪检测450nm处各孔od值。以标准品的浓度为纵坐标，od值为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线对应的od值，即可算出样品vegf的浓度。对比例5以cⅱ-3替换实施例4中的美蠊肽b溶液，将cⅱ-3浓度设置为低、中、高剂量组(25、50、100μg/ml)，按照实施例4的方法计算vegf的浓度。对比例6以脱脂膏替换实施例4中的美蠊肽b溶液，将脱脂膏浓度设置为低、中、高剂量组(25、50、100μg/ml)，按照实施例4的方法计算vegf的浓度。实施例5、对比例5和对比例6的vegf含量见表3。表3美蠊肽b、对比例5和对比例6处理后hepg2细胞中vegf的含量(n＝3)各组培养24和48h后vegf含量比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点测量的vegf含量比较，差异有统计学意义(f＝4773.712，p＝0.000)；②不同药物处理后的vegf含量比较，差异有统计学意义(f＝45.148，p＝0.000)；③各组的vegf含量抑制率变化趋势有差异(f＝4.917，p＝0.001)。与对照组相比，美蠊肽b作用24h后，hepg2细胞上清中vegf的含量降低，且呈浓度依赖性。低剂量和中剂量的美洲大蠊cⅱ-3对hepg2细胞上清中vegf的表达无明显作用，而高剂量的cⅱ-3促进vegf的表达。低剂量和中剂量的脱脂膏对vegf的表达有下调作用，但随着浓度增大，vegf的表达反而增多。各药之间作用比较，美蠊肽b下调vegf含量作用优于脱脂膏和cⅱ-3(见表3)。美蠊肽b与cⅱ-3和脱脂膏相比，vegf含量抑制率分别为27.96％和5.36％。美蠊肽b与阳性对照(沙利度胺100μg/ml)相比，vegf含量抑制率为2.844倍，沙利度胺的浓度为200μg/ml时，与美蠊肽b对vegf含量抑制性接近。随着时间延长，作用48h后，各组hepg2细胞上清中vegf的含量增多，但是经过美蠊肽b作用后，vegf的含量下降。而cⅱ-3和脱脂膏作用后，vegf的含量在一定程度上增加。这说明美蠊肽b能够有效抑制vegf蛋白的表达，抑制效果上，优于cⅱ-3和脱脂膏。美蠊肽b与cⅱ-3和脱脂膏相比，vegf含量抑制率分别为24.99％和22.79％。美蠊肽b(100μg/ml)的vegf含量抑制率是阳性对照(沙利度胺)的3.39倍，并且沙利度胺的浓度为200μg/ml时，其对vegf含量抑制性也不及美蠊肽b。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>大理大学<120>一种具有抗肝癌活性的美蠊肽b及其应用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<400>1aspaspleuargglyaspasnasp15当前第1页12