一种白僵菌固体培养基及其制备方法与流程

本发明属于白僵菌培养技术领域，尤其涉及一种白僵菌固体培养基及其制备方法。

背景技术：

白僵菌是一类对农林害虫寄主范围广且致病性强的昆虫病原真菌，因其易培养、不寄生天敌、对环境友好、适宜条件下易形成流行病等特点，成为目前国内外研究最多应用最广的害虫生防病原真菌，已成功用于大规模防治松毛虫、玉米螟、蛴螬和大豆食心虫等多种重要的农林业害虫。

目前，白僵菌大量培养的主要方式有液体发酵、固体发酵和液固两相发酵。白僵菌液体发酵时间短，主要产物为芽生孢子和菌丝体，但这两种产物的存活时间较短，不宜加工为制剂形式；固体发酵和液固两相发酵时间长，但均可产生贮存期较长的分生孢子。现有研究与生产工艺中，固体发酵和液固两相发酵所用到的固体培养基通常选用豆粉、玉米粉、蚕蛹粉、麦麸、细米糠或甘蔗渣及其他农副产品为基质，多采用两种及以上基质混合，各组分比例需严格控制，同时还需加入蛭石、稻谷壳等填充料，以在发酵过程中起到排湿、通气的作用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白僵菌固体培养基及其制备方法，本发明提供的白僵菌固体培养基价格低廉，来源充足，且用于白僵菌培养时，发酵周期短，产孢量高。

本发明提供了一种白僵菌固体培养基，以玉米颗粒作为基质。

本发明以玉米颗粒作为白僵菌固体培养基基质，原料来源易得，价格较低，多数地区可以就地取材，减少了运输费用，大大降低了生产成本，适合不同规模企业及研究单位进行白僵菌研究与生产，具有显著的经济价值和良好的应用前景。

在本发明中，所述玉米颗粒可以是玉米粉碎后的玉米颗粒，其粒径为2mm～4mm，含水量为20％～30％。

在本发明中，所述固体培养基还包括氮源；所述氮源选自花生粉、豆粉、鱼粉、酵母粉或牛肉膏，添加量为玉米颗粒的0.2～1wt％。

在本发明中，所述固体培养基还包括无机盐，所述无机盐包括kh2po4、mgso4·7h2o和kno3。所述无机盐以水溶液的形式加入到玉米颗粒中，无机盐水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米颗粒的0.2％～0.6wt％添加。

本发明还提供了一种白僵菌固体培养基的制备方法，包括：

将玉米颗粒浸泡，捞出控水加油搅拌均匀后灭菌，得到固体培养基。

在本发明中，所述玉米颗粒由玉米经过粉碎机粉碎后得到，其粒径为2mm～4mm，大小颗粒混杂即可。

将玉米颗粒在水中浸泡使其吸水，所述浸泡的温度为常温，浸泡至玉米颗粒含水量为20％～30％，优选至25％。将玉米颗粒捞出并控干多余水分，添加少量植物油防止后续灭菌过程中玉米颗粒黏成团，所述油可以是色拉油，添加量为玉米颗粒重量的0.5％左右。

将玉米颗粒与油混合均匀后灭菌前还可以加入氮源和/或无机盐水溶液，混合均匀。其中，所述氮源选自花生粉、豆粉、鱼粉、酵母粉或牛肉膏，添加量为玉米颗粒的0.2～1wt％。所述无机盐水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米颗粒的0.2％～0.6wt％添加。

混合均匀后，将混合物料装入容器内进行灭菌，所述灭菌的温度为121～125℃；压力为0.1～0.15mpa；时间为30～60分钟。灭菌完毕后即可得到白僵菌固体培养基。

该白僵菌固体培养基既可以用于白僵菌的固体发酵，也可以用于白僵菌的液固两相发酵。

本发明还提供了一种白僵菌的培养方法，包括：

将白僵菌接种至上述技术方案所述的固体培养基中进行发酵培养。

获得固体培养基后，将白僵菌接种液接种培养即可。

其中，白僵菌接种液可以孢悬液、菌丝体或芽生孢子的形式接入固体培养基中，浓度为5×10⁶～5×10⁷个/ml，接种量为10～20％(v/w)。

在本发明中，所述发酵培养的温度为20～26℃，可以采用袋装或盒装等密闭式培养，也可采用浅盘、培养池等开放式培养。

在一个实施例中，在发酵培养过程中，首先密闭培养，待长满菌丝体后，在托盘中采用开放式培养。在菌丝生长阶段采用密闭培养，可保证培养料的湿度维持在较高水平，在满足菌丝生长的需要的同时，还可以降低培养基污染的概率；产孢阶段将培养料倒在托盘中采用开放式培养，此时固料已布满白僵菌菌丝，不易污染杂菌，同时可降低培养湿度，有利于分生孢子的形成及成熟脱落。

上述培养完成后，将固体培养基在干燥通风处晾干，待培养料含水量低于5％时，可通过分孢器分离获得分生孢子粉，加工为可湿性粉剂、粉剂或油悬剂等剂型；也可以直接将培养料进行二次粉碎直接施用到田间，既起到杀虫作用，培养料也可作为土壤肥料。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明以玉米为固体培养基，由于玉米颗粒本身具有一定的粒径，培养基本身形成一定的间隙，因此培养过程中无需额外通气，无需添加其他填料增加透气性。

(2)该发明操作过程较为简单，容易实现规模批量生产，生产条件和生产过程可人为调控，生产质量容易控制。固体发酵基质可经分孢器获得含量较高的分生孢子粉，进一步加工为可湿性粉剂等多种剂型；也可以直接将玉米培养料直接二次粉碎，通过撒施、沟施或穴施施用到田间，使用更加方便快捷。

(3)本发明固体培养基主要基质为玉米，相对于白僵菌其他固体培养基，原料来源易得，价格较低，多数地区可以就地取材，减少了运输费用，大大降低了生产成本。适合不同规模企业及研究单位进行白僵菌研究与生产，具有显著的经济价值和良好的应用前景。

(4)本发明提供的固体培养基可用于白僵菌固体发酵和液固两相发酵工艺，培养方法操作方便，发酵周期短，产孢量高。

具体实施方式

实施例1接种白僵菌孢悬液的固体培养方法

1孢悬液制备

1.1菌种活化：将低温保存的白僵菌菌株jcf(保藏编号为cgmccno.11338)在试管斜面上活化培养，所用活化培养基为通用的sday培养基，培养条件为26±1℃，斜面长满孢子后即可使用。

1.2孢悬液制备：将1.1中斜面上的分生孢子转接到sday平板培养基，产孢后用0.1％吐温-80无菌水漂洗孢子，震荡悬浮制成孢悬液，调整浓度为1×10⁷孢子/ml。

2固体培养

2.1固体培养基制作：玉米用粉碎机打成碎颗粒，大小为2～4mm左右，加水浸泡4h，平均含水量为25wt％，捞出控去多余水分，加0.2％鱼粉作为氮源，加0.5％色拉油以防粘连，搅拌均匀后分装到40cm×22cm大小的聚丙烯pp塑料袋内，每袋装400g湿料。用直径4cm、长6cm的聚丙烯pp管扎口，管口依次用三层棉布和封口膜封口，121℃高温蒸汽灭菌40min，形成固体培养基。

2.2接种及培养：将已灭菌的固体培养基放置在接种室中，待冷却后在无菌操作台中按10％(v/w)比例接入白僵菌孢悬液并抖落均匀，去掉最外层封口膜，将固体料平铺展开放置在培养箱中，24±2℃条件下培养，无需额外增加湿度，24h～48h内，翻动2次固料以增加底部固料通气量，同时也可避免发酵过程中热量累积而出现“烧料”现象。4～5d时，待固体培养料长满白僵菌菌丝后，将固体培养料倒在托盘中进行开放式培养，有利于孢子脱落，固体料厚度以3～4cm为宜，此时培养箱湿度应低于50％。

2.3培养料处理：白僵菌形成分生孢子后，将固料置于通风处或干燥间内晾干，固料含水量低于5％时粉碎后即可得粗粉剂。

2.4培养结果：固体发酵周期为8d，固体培养料晾干后，随机称取3g放在装有玻璃珠的100ml0.1％吐温-80水中，震荡，使分生孢子充分洗脱，血球计数板计数，3次测量取平均值，培养物分生孢子含量为1.8×10¹⁰个/克料。

实施例2接种白僵菌菌丝体的固体培养方法

1菌丝体种子液制备：

1.1菌种活化：方法同实施例1。

1.2菌悬液制备：方法同实施例1，孢悬液浓度为5×10⁷孢子/ml。

1.3摇瓶培养：在500ml三角瓶中装入sdy培养基100ml，121℃高温蒸汽灭菌30min，待冷却后，在无菌操作台中，按1％接种量接入孢悬液，26±1℃、200rpm恒温震荡培养，培养20h后，形成菌丝体即可作为白僵菌固体培养的种子液。

2固体培养

2.1固体培养基制作：方法同实施例1，氮源为0.8％花生粉。

2.2接种及培养：将接种后混合均匀的固体培养料倒在灭菌消毒的培养盒中培养，其他方法同实施例1。

2.3培养料处理：方法同实施例1。

2.4培养结果：固体发酵周期为6d，血球计数板计数，3次测量取平均值，培养物分生孢子含量为4.5×10¹⁰个/克料。

实施例3接种白僵菌芽生孢子的固体培养方法

1芽生孢子种子液制备：

1.1菌种活化：方法同实施例1。

1.2菌悬液制备：方法同实施例1，孢悬液浓度为5×10⁶孢子/ml。

1.3摇瓶培养：在500ml三角瓶中装入sdy培养基100ml，121℃高温蒸汽灭菌30min，待冷却后，在无菌操作台中，按1％接种量接入孢悬液，26±1℃、200rpm恒温震荡培养，培养28h后，形成大量芽生孢子即可作为固相发酵的种子液。

2固体培养

2.1固体培养基制作：同实施例1，氮源为0.5％豆粉。

2.2接种及培养：同实施例1。

2.3培养料处理：同实施例1。

2.4培养结果：固体发酵周期为8d，血球计数板计数，3次测量取平均值，培养物分生孢子含量为3.2×10¹⁰/克料。

实施例4在固体培养基中添加无机盐

1菌丝体种子液制备：

1.1菌种活化：方法同实施例1。

1.2菌悬液制备：方法同实施例1，孢悬液浓度为5×10⁷孢子/ml。

1.3摇瓶培养：方法同实施例2。

2固体培养

2.1固体培养基制作：方法同实施例1，氮源为1％牛肉膏，在固体培养基中按湿料重的0.4％添加无机盐水溶液(成分为0.05％kh2po4、0.01％mgso4·7h2o、0.2％kno3)。

2.2接种及培养：同实施例1。

2.3培养料处理：同实施例1。

2.4培养结果：固体发酵周期为6d，血球计数板技术，3次测量取平均值，培养物分生孢子含量为6.5×10¹⁰/克料。

比较例1

为更进一步说明玉米发酵培养基工艺简单、发酵周期短，比较了白僵菌jcf(保藏编号为cgmccno.11338)在玉米发酵培养基和大米培养基、玉米粉培养基、常规真菌培养基sday及pda的发酵水平，结果参见表1，表1为本发明比较例提供的白僵菌在不同固体培养基上的生长情况及产孢水平。

表1白僵菌在不同固体培养基上的生长情况及产孢水平

表1中，玉米培养基即为实施例1制备的固体培养基，大米培养基基质为低值粳米，玉米粉培养基成分包括4％玉米粉、1.5％琼脂和余量的水。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。