本发明属于食源性生物活性肽开发技术领域，具体涉及以牛乳或者酪蛋白为原料制备具有降血压及抗血栓活性多肽的制备方法。
背景技术：
由于现代人们工作压力大、生活节奏快，以及睡眠不足、过度饮食、嗜烟和酗酒等不良的生活习惯的影响，心脑血管疾病中的血栓性疾病现已成为人类的头号杀手，目前，心血管疾病在欧洲每年造成几百万人过早死亡，在我国心血管疾病流行趋势越发显著。据调查，我国心血管疾病患病率男性为1.78%，女性1.10%，且患病率随年龄升高而增加，我国每年有近350万人死于心血管疾病，占总死亡人数的41%以上。
目前血栓性疾病属于主要危害我国居民生活健康的心脑血管疾病之一，而高血压是心血管疾病的一个主要诱因。用来治疗血栓的药物主要有肝素、华法林等，虽效果较好但是都存在一定的副作用，如血小板减少和引起出血等。同样，用于治疗高血压的药物主要为ace抑制剂（acei）类药物，如依那普利、卡托普利、赖诺普利等，虽可以有效地抑制ace的活性，降低血压，但是有明显的副作用，长期服用会导致降压过度、泌尿系统病变、咳嗽、味觉失真及血管神经性水肿等副作用。认识到这些药物的缺点，人们开始研究开发更安全健康的降血压、抗血栓药物。在这种背景下，生物活性肽由于其吸收性好、安全性高的特性引起了广大研究者的关注。目前，已经有研究报道了某些肽类化合物可显著抑制血管紧张素转换酶或者凝血酶活性，具有显著的降血压及抗血栓活性。按活性肽的来源不同可将其分为非食源性肽和食源性肽两大类，其中非食源性抗凝肽已有较长的研究历史，而食源性抗凝肽的研究近年来才引起广泛的关注。
目前，从预防的角度来说，抑制相关生理系统关键酶或者关键因子的活性是开发降血压及抗血栓产品的主要切入点，是公认的较为理想的选择。对于降血压及抗血栓活性产物来说公认的最关键作用靶点分子分别是血管紧张素转换酶及凝血酶。
血管紧张素转换酶是含有zn2+的金属肽酶，zn2+结合位点是血管紧张素转换酶催化反应的活性基团所在部位。血管紧张素转换酶抑制肽(降血压肽)能与血管紧张素转换酶活性部位的zn2+结合使之失活，从而阻碍血管紧张素转换酶催化水解血管紧张素ⅰ成为血管紧张素ⅱ,以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程,起到降血压的作用。从最初1965年ferreira等从美洲茅头蝮蛇的蛇毒中发现第一个降血压肽到后期以牛奶蛋白、小麦胚芽蛋白、猪血红蛋白、鱼蛋白、米渣蛋白、芝麻蛋白等为原料采用体外酶解、生物酶解、体内消化等方式获得超过千种降血压肽。
水蛭素是较早被研究的可以抑制凝血酶活性的多肽，水蛭素与凝血酶分子表面上碱性氨基酸组成的纤维蛋白原识别位点结合，使凝血酶构型发生轻微改变，进而水蛭素与凝血酶的酶活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性，阻止凝血酶和纤维蛋白原相互作用。采采蝇凝血酶抑制剂tti是从采采蝇的唾液腺提取物中分离得到的，比较n–端氨基酸顺序发现其与己经鉴定的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其他天然抗凝剂无同源性。壁虱抗凝肽tap是由60个氨基酸组成的单链酸性肽，可以与凝血酶的催化位点结合，分子结构与水蛭素类似，其通过与xa因子结合，从而阻止凝血激酶复合物的形成，以抑制凝血酶原的激活。线虫抗凝肽是一系列小分子多肽，通过与凝血因子活性位点结合，来抑制凝血原酶或凝血酶合成。比伐卢定是一种合成的凝血酶抑制剂，属于水蛭素衍生出的小分子多肽。比伐卢定同凝血酶结合形成1:1复合物，直接抑制凝血酶活性，从而起到抗凝作用，但其抑制凝血酶活性的持续时间较短。美拉加群是一种纤维蛋白二肽类似物，其抗凝机制是与凝血酶活性位点结合，可以竞争性直接抑制凝血酶。目前已报道的各类具有抗凝血功能的活性肽，有些本身是动物唾液或毒液的有效成分，尽管抗凝效果良好，但同时也可能具有强烈的副作用，存在安全隐患；有些抗凝血肽在天然生物体内含量极少，分离和纯化成本高，所以大多数多肽难以规模化生产；还有的抗凝血肽活性周期短、有的不能口服等。这些弊端促使研究者们极力开发食源性的抗凝血肽，而且这些抗凝血物质的开发都是从临床药物的角度进行的。对于血栓的早期预防，从功能性食品组分的角度入手是较为理想的手段。
多数食物蛋白质中都存在生物活性肽序列，通过酶解作用可将食物蛋白序列中的肽释放出来，得到多种具有生物功能或生理效应的活性肽。食源性抗凝血活性肽是指以天然动物或植物蛋白为前体物质，直接提取或进行再加工获得的具有相关生物活性的多肽。相关应用基础研究和产品开发凸显出重要意义。
近年来，从不同食物蛋白中寻找具有降血压、抗凝血功能蛋白水解物的研究逐渐受到关注。rafik等以乌贼肌肉为原料，用多种蛋白酶水解，利用葡聚糖凝胶层析法和反相高效液相色谱法分离得到3种具有降血压活性的多肽，经鉴定，ace抑制活性最强的是met-ala-trp，ic50为16.32μmol/l。tsai等以文蛤肉为原料，用复合蛋白酶水解，得到具有ace抑制活性的二肽，氨基酸序列为tyr-asn，其ic50为51μmol/l。shimizu等利用木瓜蛋白酶(papain)水解猪肉，分离得到的肽组分对大鼠给药后显示较好的抗血栓活性。杨万根等利用alcalase2.4l和proteasen水解蛋清蛋白，得到了具有抗凝血活性的水解产物。rajapakse等从鱼肉蛋白酶解物中获得了具有抗凝血和抑制血小板聚集的单链单体蛋白。聂毅磊等使用胰蛋白酶水解明胶，发现明胶水解物的抗凝效果显著。还有研究发现来源自k–酪蛋白的抗血栓活性肽能够减少凝血酶引起的血小板聚合，并呈显著的量效关系。但这些研究水解过程的控制具有一定的盲目性，而且大都停留在实验室阶段，这是此类产品开发中的技术瓶颈。
目前采用各种方式获得的兼具降血压及抗血栓活性的多肽鲜有报道，仅有2012年rojas–ronquillo等通过发酵牛乳酪蛋白从β-酪蛋白中鉴定出兼具降血压及抗血栓活性的17肽yqepvlgpvrgpfpiiv（aa192-209）。酶解法制备活性多肽是利用蛋白酶水解蛋白的特定氨基酸位点，从而得到具有生物活性的多肽。该方法操作相对简单、生产条件温和、产品安全性高，是获得食品级生物活性肽的常用方法。我国牛乳资源丰富，酪蛋白是多种生物活性肽的良好来源，因此将酪蛋白为原料开发鉴定兼具降血压及抗血栓活性肽具有积极重要的意义。采用酶法水解制备凝血酶抑制肽正日益受到国内外学者的重视，将其进一步开发作为功能性食品配料用于预防心脑血管疾病，具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的是解决酪蛋白多种功能活性肽开发利用中存在的技术问题，本发明提供了一种制备同时具有降血压及抗血栓活性肽的制备方法。本发明对于牛乳多功能保健食品及药品的开发及利用具有重要意义。
本发明的技术方案是这样实现的：制备方法步骤如下：
一、将酪蛋白溶于ph为7.0～8.0的水溶液中，加热至50～90℃处理5～10min，冷却至室温后得到酪蛋白溶液；
二、将步骤一样品冷却至室温后调节体系的ph，然后加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液；
三、对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量1k～10kda的膜进行超滤过滤，得到过滤后的酶解溶液；
四、将过滤后的酶解溶液在50～75℃、15～30mpa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；
五、将均质后的酶解溶液采用反渗透的方式进行脱盐处理，经杀菌、干燥后得到分子量低于5000的多肽质量百分含量占40%～80%的降血压及抗血栓活性多肽。
六、采用分子垂钓等方式，获得目标序列的多肽；
1、采用分子垂钓的方式筛选在酶解混合物中，究竟是哪个肽与凝血酶进行相互作用分析。采用生物膜干涉技术（bli）进行分析。该方法的原理是，一束可见光穿过光纤，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，叠加形成一束干涉光谱，分子结合导致膜层厚度变化，并通过干涉光谱的位移值而体现。
2、将凝血酶固定到“通用型传感器”如streptavidin(sa)、superstreptavidin(ssa)、highprecisionstreptavidin(sax)、aminereactive2ndgeneration(ar2g)、aminopropylsilane(aps)；或者“捕获型”传感器如anti-penta-his(his)、ni-nta(his)、anti-gst等传感器上。
3、采用吸附缓冲溶液对传感器进行洗脱，将未结合或结合不牢固的凝血酶洗脱下来。
4、将酶解得到的多肽混合物浓度控制在1～1000ug/ml，并以一个合适的流速流过传感器表面。
5、采用缓冲溶液对传感器进行洗脱，将未结合或结合不牢固的多肽洗脱下来。
6、采用脱附缓冲溶液对结合在传感器的多肽进行洗脱，收集各组分进行uplc-q-tof-ms的检测，确定与凝血酶亲和力强大的多个活性肽的氨基酸序列asn-met-ala-ile-asn-pro-ser-lys-glu-asn-leu-cys-ser-thr-phe-cys-lys。
7、上述筛选出的多肽再根据分子对接的活性大小，综合判定，最终筛选出符合要求的多肽。
七、采用固相合成的方式得到多肽产品。
进一步地，当步骤2）所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，使用碱性调节剂调节酪蛋白溶液体系的ph至7.0～8.5，然后在45～65℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g胰蛋白酶进行水解反应5～180min。
进一步地，当步骤2）所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的ph至6.0～8.0，在50～60℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g菠萝蛋白酶进行水解5～180min。
进一步地，当步骤2）所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的ph至5～7，在50～65℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g木瓜蛋白酶进行水解反应5～240min。
本发明所述的具有降血压及抗凝血活性的生物活性肽的制备方法，以牛乳或者酪蛋白为原料，选取合适的蛋白酶，在一定条件下酶解制备酪蛋白降血压及抗凝血活性肽粗产品，然后采用膜技术进行浓缩，采用反渗透的方式进行脱盐，并采用真空冷冻干燥技术或者低温喷雾干燥技术，最终制备得到降血压及抗血栓肽。
本发明的有益效果为：1、以酪蛋白为原料开发具有降血压及抗凝血活性肽段，目前并未见相关专利文献；经过鉴定，根据本发明所述酶解制备方法制备的具降血压及抗血栓活性肽不同于目前报道的同类产品。该肽血管紧张素转换酶抑制率及凝血酶抑制肽的抑制率较高，该1mg抗血栓肽干粉的凝血酶抑制率分别为30～80%及70～98%。2、采用牛乳或者酪蛋白为原料开发生物活性肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产。对于牛乳产品多样化，酪蛋白生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。
实施例一
本实施方式所述的具有降血压及抗血栓活性多肽的氨基酸序列为asn-met-ala-ile-asn-pro-ser-lys-glu-asn-leu-cys-ser-thr-phe-cys-lys。
本发明降血压及抗血栓的活性肽酶解制备方法按下列步骤实施：
一、将酪蛋白溶于ph为7.0～8.0的水溶液中，加热至50～90℃处理5～10min，冷却至室温后得到酪蛋白溶液；
二、将步骤一样品冷却至室温后调节体系的ph，然后加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液；
三、对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量1k～10kda的膜进行超滤过滤，得到过滤后的酶解溶液；
四、将过滤后的酶解溶液在50～75℃、15～30mpa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；
五、将均质后的酶解溶液采用反渗透的方式进行脱盐处理，经杀菌、干燥后得到分子量低于5000的多肽质量百分含量占40%～80%的降血压及抗血栓活性多肽。
六、肽的固相合成：
1合成顺序：从序列c端到n端，步骤如下：a.称取n当量树脂放入反应器，加入dcm(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉dcm，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的diea，适量的dmf，dcm，diea（二异丙基乙胺）、dmf（二甲基甲酰胺）、dcm，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用dmf、meoh洗净；b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸（也为2n当量），2n当量hbtu（1－羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐）及diea，n2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除fmoc（9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测；c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量（切割液和树脂大约以10ml/克的比例）的切割液（组成是95%tfa，2%乙二硫醇，2%三异丙基硅烷，1%水），震荡，滤掉树脂；e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；2多肽纯化：开发新工艺用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。3多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
本实施例的步骤一中的酪蛋白可以是牛奶为原料通过调酸沉淀的方式得到酪蛋白，也可以用商品化的酪蛋白或者酪蛋白酸钠产品。步骤一中ph为7.0～8.0的水溶液，是指氢氧化钠的水溶液。
当步骤二所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，使用碱性调节剂调节酪蛋白溶液体系的ph至7.0～8.5，然后在45～65℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g胰蛋白酶进行水解反应5～180min；
当步骤二所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的ph至6.0～8.0，在50～60℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g菠萝蛋白酶进行水解5～180min；
当步骤二所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的ph至5～7，在50～65℃恒温水浴条件下加入500～10000u/g木瓜蛋白酶进行水解反应5～240min；
本实施方式通过酶水解及超滤过滤使抗血栓肽产品中分子量低于5000da的多肽含量尽可能多：
1、通过采用合适的酶添加量（500～10000u/g）、控制酶解时间（5～240min）、控制有效的体系温度（40～65℃）、体系ph（6.0～9）等参数控制酶解过程；
2、将水解液灭酶后离心取上清，进行超滤处理，通过控制超滤膜的孔径范围（1k～10kda）等方法实现产物的有效分子量截留。
本实施方式发现分子量较低的多肽具有更好的生物学活性。对于抗血栓活性而言，分子量较小的多肽能够和凝血酶的活性部位更好的结合，分子量较大的肽段空间位阻较大会影响其本身与血管紧张素转换酶及凝血酶的结合。因此，分子量低于5kda的多肽含量越高，产品的生物学活性越好。
实施例二：本实施方式与实施例一不同的是步骤一所述的酪蛋白蛋白溶液的浓度为4wt%～12wt%。其它步骤及参数与实施例一相同。
实施例三：本实施方式与实施例一或二不同的是步骤二中所述的碱性调节剂为naoh溶液、koh溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。其它步骤及参数与实施例一或二相同。
实施例四：本实施方式与实施例二不同的是步骤一所述的酪蛋白的制备过程如下：将牛奶经过离心脱脂处理，制备得到脱脂乳，调节脱脂乳ph为4.5～4.8，静置离心收集沉淀，得到酪蛋白。其它步骤及参数与实施例二相同。
实施例五：本实施方式与实施例一不同的是步骤二中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及胰酶之间两种及多种蛋白酶复合酶解。其它步骤及参数与实施例一相同。
实施例六：本实施方式与实施例一不同的是当步骤二所述的蛋白酶胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及胰酶的复合蛋白酶时，灭酶处理是在80～100℃下灭酶5～20min。其它步骤及参数与实施例一相同。
实施例七：本实施方式与实施例一至六之一不同的是当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及胰酶，灭酶处理是滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的ph至4.0～5.0或者10-12。其它步骤及参数与实施例一至六之一相同。
实施例八：本实施方式与实施例一至七之一不同的是步骤五所述的杀菌处理是在管式热交换器中以130～142℃的温度进行超高温瞬时杀菌2～8s。其它步骤及参数与实施例一至七之一相同。
本实施方式步骤五也可以通过膜过滤除菌结合巴氏杀菌的方式。采用0.2～1.2μm孔径的无机陶瓷膜进行过滤除菌，然后进行62～65℃的巴氏杀菌，处理时间为20～30min。
实施例九：本实施方式与实施例一至八之一不同的是步骤五所述的干燥处理是通过真空冷冻干燥法，控制冷阱温度-73～-40℃，真空度为0.01～0.5mbar，干燥时间为3～24h。其它步骤及参数与实施例一至八之一相同。
实施例十：本实施方式与实施例一至九之一不同的是步骤五所述的干燥处理是先加入占杀菌后的酶解溶液重量2%～3%的麦芽糊精和0.5%～2%的β-环状糊精，再通过喷雾干燥方法进行干燥处理，喷雾干燥时的进风温度为145～200℃，排风温度为70～95℃。其它步骤及参数与实施例一至九之一相同。
实施例十一：本实施方式与实施例一至十之一不同的是步骤六所述的干燥处理是通过120～160℃（低温）低温喷雾干燥法进行的。其它步骤及参数与实施例一至十之一相同。
本实施例在多肽产品中采用q-tof质谱技术鉴定出具有降血压及抗血栓活性多肽nmainpskenlcstfck来自于α-s2-酪蛋白（alpha-s2-casein）。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>大连工业大学
<120>一种生物活性肽及其制备方法
<130>2017.6.12
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>17
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
asnmetalaileasnproserlysgluasnleucysserthrphecys
151015
lys