一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及基于荧光pcr检测技术，具体涉及一种基于荧光pcr检测esr1基因突变的引物及探针。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占中国女性恶性肿瘤之首。随着我国经济的发展和生活方式的改变，发病率也呈现快速上升的趋势。由于民众筛查意识的提高及诊疗水平的提高，乳腺癌患者的总体死亡率呈下降趋势。然而，对于耐药复发和有转移病灶的晚期乳腺癌患者预后仍然很差，也是目前女性肿瘤的主要死亡原因之一。

人类雌激素受体α(estrogenreceptoralpha,esrα)由esr1(estrogenreceptor1)基因编码。esrα与其配体雌激素结合后，可激活细胞内一系列的细胞生物学效应。esr1基因的突变和异常表达均与乳腺癌等疾病的发生有关。

esr1基因最为常见的突变类型为y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变。这些突变将esr1转换为了促癌基因，他们将er锁定在一种永久激活的状态，因此无需激素就可以趋势肿瘤细胞生长。这就解释了这些肿瘤会对芳香酶抑制剂产生耐药的原因。

目前已报道的应用于esr1检测的方法主要为：直接测序法及二代测序技术。其中，直接测序技术成本低，准确性高，但是操作复杂，需要pcr后处理等步骤，易污染导致出现假阳性的结果,而且此方法的灵敏度不足，需要基因丰度达到10％时才能精确检出，故很难在临床中进行推广。二代测序技术灵敏度高，但是需要昂贵的仪器及分析设备，导致其检测成本大大提高，难以作为普适技术。综上所述，不论是：直接测序法还是二代测序技术在检测成本和检测精度上存在不足，需要进一步改进。

技术实现要素：

为了克服传统检测技术的缺陷，本发提供了一种基于荧光pcr检测esr1基因突变的引物及探针，通过设计等位基因特异性引物，在一个反应中检测esr1基因突变。本发明具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速等优点。本发明具体如下：

一种基于荧光pcr检测esr1基因突变的引物及探针，包含下列4组下游引物、1组通用上游引物和1组共用阻断探针，具体为：

(1)针对esr1基因y537s突变的下游引物：y537s1、y537s2和/或y537s3，具体为：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s2：5’-tctccagcagcaggtaag-3’

y537s3：5’-ctccagcagcaggtctg-3’；

(2)针对esr1基因y537c突变的下游引物：y537c1、y537c2、y537c3和/或y537c4，具体为：

y537c1：5’-ctccagcagcaggtctc-3’

y537c2：5’-tctccagcagcaggttac-3’

y537c3：5’-ctccagcagcaggtgac-3’

y537c4：5’-tctccagcagcaggtttc-3’；

(3)针对esr1基因y537n突变的下游引物：y537n1、y537n2、y537n3和/或y537n4，具体为：

y537n1：5’-tccagcagcaggtcaat-3’

y537n2：5’-tccagcagcaggtcact-3’

y537n3：5’-ctccagcagcaggtcttt-3’

y537n4：5’-ccagcagcaggtcgtt-3’

(4)针对esr1基因y538g突变的下游引物：y538g1、y538g2、y538g3和/或y538g4，具体为：

y538g1：5’-catctccagcagcagcc-3’

y538g2：5’-catctccagcagcacgc-3’

y538g3：5’-catctccagcagcaccc-3’

y538g4：5’-gcatctccagcagcagcc-3’；

(5)针对esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g突变的通用上游引物fp1、fp2、fp3、fp4和/或fp5，序列如下：

fp1：5’-tagtcctttctgtgtcttccca-3’

fp2：5’-ggctcgggttggctctaa-3’

fp3：5’-agtaacaaaggcatggagca-3’

fp4：5’-ttccccttctagggatttcagcact-3’

fp5：5’-actcctggggctcgggttggc-3’；

(6)针对esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g突变的共用阻断探针，该阻断探针的序列及修饰如下：

阻断探针：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’。

进一步说，包括一对内控引物及一条内控引物探针；所述内控引物由tbpfp和tbprp组成，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

内控引物探针序列信息如下：

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

进一步说，针对esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变的下游引物为等位基因特异性引物。

本发明机理:

本发明结合等位特异性pcr技术(arms技术)对现有引物及探针进行改进，采用本发明的产品能够达到操作便捷、成本低的效果，而且本发明的灵敏度也大大提高了检测，从而可以达到快速准确检测基因突变的目的。

等位基因特异性pcr(allele-specificpcr),也称为arms(amplificationrefractorymutationsystem)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据pcr过程中dna聚合酶引导的引物延伸从、引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和pcr反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(a-t，g-c)，则引物可以不间断延伸，pcr得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，pcr效率大大降低。

故将与突变位点对应的碱基放置在引物的3'末端，同时在必要时人为引入其他碱基的错位配对，便可以达到选择性扩增某种等位基因的作用。从而达到快速准确检测基因突变的目的。

本发明技术方案带来的有益效果

(1)灵敏度高：在本发明中，esr1突变基因在25ng背景基因下的最低检出限为0.1％，相较于传统的技术的1.0％检出限，大大提高了检测的灵敏度(提高了一个数量级)。

(2)适用范围广：基于设计中pcr反应的特点，本发明可以适用于石蜡包埋组织样本，血浆样本等。

(3)特异性强：在本发明中，针对esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变设计的特异性引物具有很高的位点特异性，保证了检测的准确性，避免了假阳性的产生。

(4)操作简单，实验时间短。闭管反应，减少了污染的机率。

综上所述，本发明在产品价格比现有的测序方法低的同时，检出限灵敏度比现有产品高出一个数量级，且适用范围宽。

附图说明

图1本发明试剂盒对血液样本突变检测结果，样本中有突变(fam通道有信号)。

图2本发明试剂盒对血液样本内控检测结果。

图3是采用本发明的实施例1的试验结果。

具体实施方式

现通过实施例详细阐述本发明的技术特点。

实施例1

1.esr1引物序列：

针对于esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变采用如下8组等位基因特异性引物，作为下游引物，序列如下：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s2：5’-tctccagcagcaggtaag-3’

y537c1：5’-ctccagcagcaggtctc-3’

y537c2：5’-tctccagcagcaggttac-3’

y537n1：5’-tccagcagcaggtcaat-3’

y537n2：5’-tccagcagcaggtcact-3’

y538g1：5’-catctccagcagcagcc-3’

y538g2：5’-catctccagcagcacgc-3’

针对四种突变采用如下2组上游引物，序列如下：

fp1：5’-tagtcctttctgtgtcttccca-3’

fp5：5’-actcctggggctcgggttggc-3’

针对四种突变设计一条共用的阻断探针，其序列及修饰如下：阻断探

针：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’

同时设计一对内控引物，及一条探针，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

将实施例1获得的发明产物的运用，具体如下：

临床样本基因组dna提取：本实例是从乳腺癌患者的血浆中提取dna，作为pcr检测的模板。才用的是tiangen的血液基因组dna提取试剂盒。

1)向15ml离心管加入200ulproteinasek(20mg/ml)溶液。

2)加入0.5-3ml血液样本，混匀。

3)向装有血液样本的离心管中加入2.4ml缓冲液ge，振荡30sec混匀。

4)65℃放置10min，每隔3min振荡一次，以助裂解。

5)向样本中加入2ml的无水乙醇，混匀。

6)将所得溶液和絮状沉淀的一半转移至一个吸附柱cb5中，3000rpm离心3min，倒掉废液，将吸附柱cb5放回收集管中。

7)将步骤6剩余的溶液再转入同一吸附柱中，重复6的操作。

8)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液gd，5000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb5放回收集管中。

9)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液pw，5000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb5放回收集管中。

10)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液pw，5000rpm离心15min，丢弃收集管，将吸附柱cb5放到一个新的15ml离心管中。

11)向吸附膜的中间部位悬空滴加300ul洗脱缓冲液tb，室温静置5min，5000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

紫外分光光度计测定样本提取量及浓度，稀释至10ng/ul待用。

仪器：

适用机型abi7500、宏石96p。

pcr反应体系：

25ulpcr反应体系中包含：y537s等位基因特异性下游引物200nm-500nm，y537c等位基因特异性下游引物200nm-450nm，y537n等位基因特异性下游引物200nm-450nm，d538g等位基因特异性下游引物200nm-450nm，通用上游引物(fp)200nm-450nm，阻断探针100nm-300nm，以及内控上游引物200nm-450nm，内控下游引物200nm-450nm，tbp探针100nm-300nm，2×sybrgreenmix10-15ul，待测样本10-50ng，ddh2o补足25ul。

pcr反应程序：

95℃，2～10min，不循环；

95℃，5～16sec，60℃，40～60sec，采集荧光；共计45个循环；

结果判定：

将配置好的各反应体系在荧光实时定量pcr仪器上进行扩增，根据esr1基因与内控基因的扩增结果(ct值)，即fam通道和hex通道的扩增情况来进行结果的判定。对结果的判定有以下三种情况：

(1)样本在fam通道和hex通道均有正常扩增，则该样本携带有esr1基因y537s,y537c,y537n或y538g四种突变中的一种或者几种。

(2)样本在fam通道没有扩增，在hex通道有正常扩增，则该样本未携带有esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变。

(3)样本在fam通道和hex通道均没有正常扩增，则表明该样本中dna量过差或者加入的dna量不足，需要重新检测。图1为采用本发明产品的试剂盒对血液样本突变检测结果，样本中有突变(fam通道有信号)。图2本发明试剂盒对血液样本内控检测结果。

下面再以100例复发性乳腺癌样本作为检测对象，采用如实施例1的检测方法，进行试验：

1)按照上述反应体系参数配置反应溶液，分别加入各乳腺癌dna样本50ng进行试验，结果如图3所示。

2)根据图3所示，本发明对100例复发乳腺癌样本dna进行检测，按样本结果判定可以得出，共有5例样本携带esr1突变，其余为esr1野生型。

实施例2

1.esr1引物序列：

针对于esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四种突变采用如下的等位基因特异性引物作为下游引物，序列如下：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s3：5’-ctccagcagcaggtctg-3’

y537c3：5’-ctccagcagcaggtgac-3’

y537c4：5’-tctccagcagcaggtttc-3’

y537n3：5’-ctccagcagcaggtcttt-3’

y537n4：5’-ccagcagcaggtcgtt-3’

y538g3：5’-catctccagcagcaccc-3’

y538g4：5’-gcatctccagcagcagcc-3’。

针对四种突变如下的3组公用的上游引物，序列如下：

fp2：5’-ggctcgggttggctctaa-3’

fp3：5’-agtaacaaaggcatggagca-3’

fp4：5’-ttccccttctagggatttcagcact-3’。

针对四种突变设计一条共用的阻断探针，其序列及修饰如下：阻断探针：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’

同时设计一对内控引物，及一条探针，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

分别从100例病人的石蜡切片样本、新鲜组织中提取dna用于检测，其他检测条件同实例1中的实验条件。结果显示，石蜡切片样本、新鲜组织中提取的dna均可用于检测，结果与实例1相同，且差异不大。