一种阳离子多肽纳米聚集体及在抗菌方向的用途的制作方法

本发明属于抗菌肽制备与应用领域，具体涉及一种基于阳离子多肽纳米聚集体的制备与抗菌方向的应用。

背景技术：

青霉素在细菌感染中的应用,使人们摆脱了细菌感染死亡的威胁。随后,越来越多的抗生素被人们发现并应用于医疗中。然而抗生素的快速发展虽然为人类的健康做出了卓越的贡献,但它却是一把双刃剑,如今随着抗生素的过度使用，细菌的耐药性问题也越来越严重。特别是医药领域抗生素的使用，使得抗生素的效果越来越弱，近年来更是因“超级耐药菌”的出现，严重威胁着人类的健康。由此研究新型抗菌剂取代传统抗生素，解决耐药性的问题迫在眉睫。

抗菌肽(antimicrobialpeptides,amps)，其广泛存在于细菌、植物、动物中,在生物体内由特定基因编码产生的一类两亲性带正电荷的小分子多肽(氨基酸数目一般12-50),是天然免疫防御系统的一个重要组成部分,被称为“第二防御体系”。重要的是抗菌肽具有其独特的杀菌机理,多数抗菌肽在溶液中带正电，而细菌细胞膜带负电，抗菌肽通过静电吸附于细胞膜，破坏膜结构，这样使细菌不易产生耐药性。因而抗菌肽有希望替代传统抗生素,成为新一类的杀菌药物。同时，抗菌肽的应用也将为食品，医药，生物等领域带来一场“绿色革命”。

目前抗菌肽与细菌的作用机理主要认为与其本身的两亲性结构以及正电性有关。多肽链段的n端一般富含阳离子型的氨基酸,且是亲水氨基酸,c端一般富含疏水氨基酸,因此抗菌肽通常具有两亲性和正电性。为获得理想的抗菌肽，在对其进行分子设计时，必须考虑到正电性和两亲性两个特点。抗菌肽所带的正电荷与微生物细胞膜的负电荷相互吸引，最终使抗菌肽接近微生物细胞膜表面。抗菌肽接近微生物细胞膜后，其亲水端与磷脂分子层(细胞膜骨架)亲水端接触，进而将疏水端插入磷脂分子层的疏水内部，干扰细胞膜的通透性。在这两种机制下，抗菌肽最终破坏微生物细胞膜，使微生物死亡。

传统的抗菌肽在溶液中通常以单体与细菌相互作用，而单体在生理环境下容易被降解丧失一定的抗菌效果，而聚集体结构的抗菌肽在溶液中更稳定，相比单体，也不易被降解，因此开发新型抗菌肽使其自组装为聚集体结构成为目前研究的热点。

人类淀粉样多肽aβ16-22(klvffae)，包含疏水核心lvff，在一定环境溶液中，能够在溶液中自组装为纤维或两端修饰后能自组装为纳米管。根据这段序列，将其中的亲水性氨基酸-丙氨酸(a)和谷氨酸(e)都替换为赖氨酸(k)，亮氨酸(l)和缬氨酸(v)都替换为苯丙氨酸(f),综合设计了两亲性多肽序列kkkfafafafakkk和kkkfafafafakkk，两段多肽在溶液中带正电荷(ph＝1～10，电位图见图2)，使其具备抗菌肽特征，又同时具备自组装的能力。

技术实现要素：

制备阳离子多肽纳米聚集体，并用于光热杀菌。该纳米聚集体结构比较稳定，不易被降解，与细菌相互作用强，可在短时间内杀死细菌。

本发明的技术方案如下：

一种阳离子多肽纳米聚集体的杀菌应用，按照下述步骤进行：

将50μl细菌悬浮液(～5×10⁶cfuml^–1)分别加入2ml阳离子多肽的纳米聚集体溶液中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔1h，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μl稀释后的悬浮液放到lysogenybroth固体培养基，在37℃培养18h，计算菌落数。

上述技术方案中所述的阳离子多肽纳米聚集体，其制备方法如下：

将浓度为80～480μgml^–1的阳离子多肽加入(ph＝6.5～8.5)的溶液中，并置于恒温振荡器上孵育30～60min(35～38℃，360rpm)，阳离子多肽自组装后形成纳米聚集体。

上述方案中所述细菌为大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌(salmonella)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中的一种。

上述方案中所述阳离子多肽为k3(fa)4k3、k6(fa)4、k2(fa)3k2、k4(fa)3、ac-k3(fa)4k3-nh2、k2(fa)2、k(fa)2k、kfa、ac-k2(fa)3k2-nh2、ac-k2(fa)2-nh2、ac-k(fa)2k-nh2、ac-k2(fa)2-nh2和ac-k6(fa)4-nh2中的一种,优选k3(fa)4k3和k6(fa)4中的一种。

上述方案中所述纳米聚集体为纳米片状聚集体、纳米球形聚集体、纳米环形聚集体、纳米棒状聚集体和纳米囊泡聚集体中的一种。

根据本发明，优选地，纳米聚集体为纳米片状聚集体或纳米球形聚集体。

根据本发明，优选地，片状聚集体尺寸为10～1000nm。

根据本发明，优选地，纳米球形聚集体尺寸10～1000nm。

上述方案中所述悬浮液和溶液为水溶液，优选纯水、磷酸缓冲液(pb)或磷酸盐缓冲液(pbs)中的一种。

本发明所制备的阳离子多肽纳米聚集体，可通过改变阳离子多肽浓度、ph、温度、时间，进而调控纳米聚集体，与细菌相互作用，在溶液中快速杀死细菌。

附图说明

图1为阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4分子结构示意图。

图2为阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4在水溶液中不同ph下的电位图。

图3为阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4纳米聚集体的原子力显微镜(afm)图。

图4为阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4纳米聚集体与细菌作用后，细菌存活率随时间的变化随时间的变化。

图5为阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的纳米聚集体与大肠杆菌作用后，扫描电子显微镜(sem)图。

图6为改变阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4在不同的浓度、溶液、溶液的ph和孵育的时间下形成的纳米聚集体的afm图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的聚集体制备：

将浓度为166μgml^–1的阳离子多肽加入37℃(ph＝7.04)的水中，并置于振荡器上孵育40min(360rpm)，阳离子多肽自组装后形成纳米聚集体，所得的形貌图见图3。由此可见，经过孵育后的多肽k3(fa)4k3自组装形成了片状纳米聚集体，经过孵育后的多肽k6(fa)4自组装形成了比较均匀的球形纳米聚集体。

实施例2

阳离子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的纳米聚集体抗菌应用：

将50μl大肠杆菌悬浮液(～5×10⁶cfuml^–1)分别加入2ml阳离子多肽自组装后的纳米聚集体溶液中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔1h，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μl稀释后的悬浮液放到lysogenybroth固体培养基，在37℃培养18h，计算菌落数。

实施例3

同实施例2，仅改变阳离子多肽抗菌步骤中细菌分别为大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌，所得的细菌存活率随时间的变化见图4。由此可见，在同一条件下，多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的纳米聚集体均能杀死细菌，但多肽k6(fa)4的纳米聚集体对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌不具有杀菌作用，可归因于，不同的细菌具有不同的生物结构和性质。

实施例4

同实施例1，仅改变阳离子多肽浓度分别为200μgml^–1，阳离子多肽自组装后形成纳米聚集体，所得的形貌图见图6a。由此可见，经过孵育后的多肽k3(fa)4k3自组装形成了纳米环形聚集体和纳米球形聚集体，经过孵育后的多肽k6(fa)4自组装形成了的纳米球形聚集体。

实施例5

同实施例1，改变阳离子多肽浓度分别为170μgml^–1、溶液为10mmpbs、ph＝7.4和孵育时间为60min,阳离子多肽自组装后形成纳米聚集体，所得的形貌图见图6b。由此可见，经过孵育后的多肽k3(fa)4k3自组装形成了纳米环形聚集体和纳米球形聚集体，经过孵育后的多肽k6(fa)4自组装形成了的纳米球形聚集体。