一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基及其制备方法。

背景技术：

嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)属于乳杆菌属，可以通过发酵碳水化合物产生乳酸，其广泛存在于人及动物的肠道中，对人体的健康，特别是对维持胃肠道的正常生理功能具有重要作用，是肠道内重要的有益微生物菌群。

由于嗜酸乳杆菌自身生长条件要求比较特殊，目前市场上的嗜酸乳杆菌产品中活菌含量均较低。为此，人们一直在积极探索能够促进其生长的物质，以提高嗜酸乳杆菌的活菌数。同时，嗜酸乳杆菌的分离培养及其酶学研究都需要有良好的增菌培养基，使嗜酸乳杆菌得以在最短时间内大量增殖，从而使其在一系列的后续操作后仍然具有足够的活菌数。因此，嗜酸乳杆菌的增菌培养基的优化成为目前一个急需解决的问题。

中国专利申请cn103255093b公开了一种嗜酸乳杆菌的制备方法，其涉及一种液体培养基，具体成分为葡萄糖2重量％，蛋白胨1重量％，牛肉膏1重量％，酵母浸膏0.5重量％，磷酸氢二钾0.2重量％，naac0.5重量％，硫酸镁0.05重量％，硫酸锰0.025重量％，吐温-800.1体积％，柠檬酸二胺0.2重量％，琼脂1.5重量％，番茄汁5重量％。该培养基制备得到的嗜酸乳杆菌还伴有大量其他有益代谢产物：乳酸菌素和l-乳酸，正丁酸，乙酸，甲酸等有机酸。这些产物是动物肠道重要的能量来源，而且能与益生菌协同作用，作用于动物，能显著提高动物的胃肠道功能、提高免疫力、促进生长；将该发明所得产物制备成饲料，动物对饲料的消化和吸收率得到提高。但是该培养基得到的嗜酸乳杆菌的活菌数较低，且嗜酸乳杆菌进入稳定期的时间长。

因此，有必要提供一种用于促进嗜酸乳杆菌生长，且能明显缩短嗜酸乳杆菌进入稳定期时间的培养基。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基及其制备方法。该培养基添加了天然生长因子，番茄汁和蒲公英提取物，两者能显著促进嗜酸乳杆菌的生长和繁殖，显著提高嗜酸乳杆菌的活菌数，且能明显缩短嗜酸乳杆菌进入稳定期的时间。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基，由以下重量的成分组成：蒸馏水1000～2000ml、硫酸镁0.2～1.0g/l、硫酸锰0.1～0.5g/l、酵母提取物10～40g/l、磷酸氢二钾1.0～4.0g/l，柠檬酸氢二铵1.0～4.0g/l、牛肉膏5～20g/l、琼脂10～20g/l、蛋白胨5～20g/l、吐温800.5～2g/l、番茄汁50～200g/l、乙酸钠7.5～30g/l、葡萄糖10～40g/l以及蒲公英提取物0.04～0.2g/l。

进一步地，所述培养基由以下重量的成分组成：蒸馏水1000ml、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.25g/l、酵母提取物20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、牛肉膏10g/l、琼脂14g/l、蛋白胨10g/l、吐温801g/l、番茄汁150g/l、乙酸钠15g/l、葡萄糖20g/l以及蒲公英提取物0.1g/l。

进一步地，所述番茄汁由以下步骤制得：

取新鲜番茄，洗净、切片后加入番茄1～2倍量的纯化水温水热烫5～15min，榨汁，过滤，调节ph为6.3，110～120℃灭菌10～15min，即得。

进一步地，所述蒲公英提取物由以下步骤制得：称取蒲公英药材，粉碎，加入药材10～20倍量的纯化水，煎煮1～3次，每次0.5～1h，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎后即得。

嗜酸乳杆菌有适宜生长的ph范围，当培养基中氢离子浓度超过嗜酸乳杆菌的适应范围后，嗜酸乳杆菌的代谢就会受到抑制。当环境ph在适宜范围内，嗜酸乳杆菌代谢活力会增强，生长繁殖加快，因此，优选地所述培养基的初始ph为6.0～6.6，更优选地，所述培养基的初始ph为6.2。

作为培养条件之一的温度对嗜酸乳杆菌的生长繁殖具有重要的影响。在适宜的温度条件下，嗜酸乳杆菌的繁殖生长更快，有利于嗜酸乳杆菌的菌数的提高。在一定范围内，温度的升高能提高细胞的生长速率，当超过最适宜温度后，温度的升高会对微生物体内的蛋白质、核酸产生影响，则生长速率随温度的升高而下降，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。因此，本发明所述培养基的初始温度优选为28～40℃，更优选为37℃。

培养过程中接种量的大小直接影响菌种的生长繁殖速度。接种量大，菌体延滞期缩短，增殖迅速，但是过快的繁殖容易导致培养基中营养物质缺乏。接种量小，菌体调整期生长缓慢，生长周期延长，容易增加染菌机会。因此，适宜的接种量是保证乳酸菌高效增殖的一个关键。优选地，嗜酸乳杆菌的接种量为2～4％，更优选地为3％。

进一步地，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌jcm1132，其保藏编号为：cgmcc1.1878相应地，本发明还提供了一种制备上述的用于嗜酸乳杆菌的培养基的方法，包括以下步骤：

a)番茄汁的制备：取新鲜番茄，洗净、切片后加入番茄1～2倍量的纯化水温水热烫5～15min，榨汁，过滤，调节ph为6.3，110～120℃灭菌10～15min，置于冰箱保存，备用；

b)蒲公英提取物的制备：称取蒲公英药材，粉碎，加入药材10～20倍量的纯化水，煎煮1～3次，每次0.5～1h，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎后即得；

c)按比例称取各组分，混合，调节ph，高压湿热灭菌，即得。

本发明另一目的在于提供一种嗜酸乳杆菌培养方法，将活化的嗜酸乳杆菌菌株按2～4％的接种量接入如上所述的培养基中，置于37℃恒温培养箱内培养20～30h，即得。

本发明具有以下优点：

本发明在基础培养基的基础上添加番茄汁和蒲公英提取物制成本发明嗜酸乳杆菌培养基，该培养基特别适用于嗜酸乳杆菌的培养，该培养基能够显著提高嗜酸乳杆菌的活菌数，明显缩短嗜酸乳杆菌进入稳定期的时间，且由于添加了天然因子，所制备得到的嗜酸乳杆菌还含有大量的有益代谢产物。

附图说明

图1显示了不同生长因子对嗜酸乳杆菌生长的影响；

图2显示了培养基初始ph值对嗜酸乳杆菌生长的影响；

图3显示了接种量对嗜酸乳杆菌生长的影响；

图4显示了培养基优化前后嗜酸乳杆菌的生长曲线。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本发明培养基配方部分成分购买信息

实施例1一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

所述培养基由以下重量的成分组成：蒸馏水1000ml、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.25g/l、酵母提取物20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、牛肉膏10g/l、琼脂14g/l、蛋白胨10g/l、吐温801g/l、番茄汁150g/l、乙酸钠15g/l、葡萄糖20g/l以及蒲公英提取物0.1g/l。

制备方法：

a)番茄汁的制备：取新鲜番茄，洗净、切片后加入番茄1倍量的纯化水温水热烫10min，榨汁，过滤，调节ph为6.3，115℃灭菌15min，置于冰箱保存，备用；

b)蒲公英提取物的制备：称取蒲公英药材20g，粉碎，加水500ml煎煮2次，每次0.5h，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎后即得；

c)按比例称取各组分，混合，调节ph为6.2，高压湿热灭菌，即得。

实施例2、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

所述培养基由以下重量的成分组成：蒸馏水1500ml、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.1g/l、酵母提取物10g/l、磷酸氢二钾1.0g/l，柠檬酸氢二铵1.0g/l、牛肉膏5g/l、琼脂10g/l、蛋白胨5g/l、吐温800.5g/l、番茄汁100g/l、乙酸钠7.5g/l、葡萄糖10g/l以及蒲公英提取物0.04g/l。

制备方法参考实施例1。

实施例3、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

所述培养基由以下重量的成分组成：蒸馏水2000ml、硫酸镁1.0g/l、硫酸锰0.5g/l、酵母提取物40g/l、磷酸氢二钾4.0g/l，柠檬酸氢二铵4.0g/l、牛肉膏20g/l、琼脂20g/l、蛋白胨20g/l、吐温802g/l、番茄汁200g/l、乙酸钠30g/l、葡萄糖40g/l以及蒲公英提取物0.2g/l。

对比例1、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

对比例1与实施例1的区别在于，去掉蒲公英提取物，将番茄汁的重量增加至150.1g/l，其余参数及操作如实施例1。

对比例2、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

对比例2与实施例1的区别在于，去掉番茄汁，将蒲公英提取物的重量增加至150.1g/l，其余参数及操作如实施例1。

对比例3、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

对比例3与实施例1的区别在于，去掉番茄汁和蒲公英提取物，用胡萝卜汁150.1g/l替代，其余参数及操作如实施例1。

胡萝卜汁的制备：

取新鲜胡萝卜200g，用纯化水洗净、切片后加200ml纯化水热烫10min，用榨汁机捣碎榨汁，双层纱布过滤汁液，调节ph6.3，115℃灭菌15min后，置于冰箱备用。

对比例4、一种适用于嗜酸乳杆菌的培养基

对比例4与实施例1的区别在于，去掉番茄汁和蒲公英提取物，用啤酒汁(青岛啤酒，330ml/瓶)150.1g/l替代，其余参数及操作如实施例1。

试验例一、不同生长因子对嗜酸乳杆菌生长的影响

取实施例1、对比例1～4所述培养基以及空白对照组(与实施例1相比，不含有生长因子番茄汁和蒲公英提取物)，各接入3％嗜酸乳杆菌活化液，置于培养箱37℃条件下中培养27h，选用酶标仪在630nm下测各组od值，每组重复3次，试验结果如表1和图1所示。

表1不同生长因子对嗜酸乳杆菌生长的影响(od630)

结果显示，与空白对照组相比，各组均有一定程度上的促进嗜酸乳杆菌的生长；其中，胡萝卜汁促生长效果最不明显，蒲公英提取物促生长效果较好；与番茄汁或蒲公英提取物单独作用相比，番茄汁和蒲公英提取物组合使用促嗜酸乳杆菌生长效果最显著。

试验二、培养基初始ph值以及嗜酸乳杆菌接种量对嗜酸乳杆菌生长的影响

2.1培养基初始ph值对嗜酸乳杆菌生长的影响

为了确定嗜酸乳杆菌生长的最佳初始ph值，用酶标仪分别测定了实施例1培养基初始ph为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8时嗜酸乳杆菌的od值，结果如图2所示。

从图2可知，不同的初始ph值对嗜酸乳杆菌产生了影响，过低或过高的初始ph值都不利于嗜酸乳杆菌的生长。当ph值为6.2时，嗜酸乳杆菌的生物长达到最高。因此，嗜酸乳杆菌的培养基初始ph值分别选定为6.2。

2.2接种量对嗜酸乳杆菌生长的影响

分别按1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接入实施例1培养基中，考察嗜酸乳杆菌的接种量对其生长的影响，结果如图3所示。

由图3可知，当接种量为2％～4％时，乳酸菌的快速生长至最高生物量，缩短培养周期；当接种量为3％时，嗜酸乳杆菌的生物量达到最大；当接种量为6％时，乳酸菌菌数有明显下降，说明接种量过大导致乳酸菌生长后期营养缺乏，造成部分菌体死亡，反而使菌数降低，因此，嗜酸乳杆菌的最佳接种量的为3％。

试验例三、优化前后培养基对嗜酸乳杆菌生长曲线的影响

将3％嗜酸乳杆菌分别接种到含200ml液体培养基(与实施例1比，不含有番茄汁和蒲公英提取物)和200ml实施例1培养基的锥形瓶中，置培养箱37℃分别培养0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、48h后，分别取200μl，选用酶标仪630nm进行测定，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，得到培养基优化前后嗜酸乳杆菌的生长曲线图4。

图4显示，用优化前的培养基(不含有番茄汁和蒲公英提取物)接种嗜酸乳杆菌后0～6h，嗜酸乳杆菌在这一时期处于生长延滞期，6～24h嗜酸乳杆菌处于对数期，24～33h进入稳定期，此后菌体开始进入衰亡期；然而优化后的培养基(增加了番茄汁和蒲公英提取物)更利于嗜酸乳杆菌的生长，嗜酸乳杆菌在经过约3h的停滞期后开始进入对数期约12h过后，菌体进入稳定期，并在21h时吸光度最大，显著缩短了进入稳定期的时间。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。