生产(R)‑乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用与流程

文档序号:11380153阅读:573来源:国知局

本发明属于生物技术领域,具体是一种生产高光学纯(r)-乙偶姻基因工程菌株的构建,及其在利用木薯粉和棉籽蛋白粉等非粮原料生产高光学纯(r)-乙偶姻中的应用。



背景技术:

乙偶姻(acetoin),化学名为3-羟基-2-丁酮,自然存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草莓、可可、肉类等食品中,具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气,高度稀释后有令人愉快的奶香气。国家标准gb2760-86规定其为允许使用的食用香料,美国食品香料和萃取物制造者协会(fema)安全号为2008,国内外常用于香味增强剂,还用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精,是一种应用广泛的食用香料。同时,乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物,被美国能源部列为30种优先开发利用的平台化合物之一,在食品、医药、烟草、化妆品、化工等行业具有广泛的用途。

乙偶姻分子含有一个手性碳原子,因此存在(r)-乙偶姻、(s)-乙偶姻两种手性异构体。乙偶姻手性异构体不仅具有乙偶姻的基本功能,而且其独特的立体结构在不对称合成方面优势突出,在合成高附加值手性药物中间体、化学中间体、液晶材料等方面具有重要应用。在制药工业中,单一构型的乙偶姻手性异构体作为具有立体结构专一的化合物可以用来合成合成具有光学活性的手性药物,从而较大程度地提高药效,减轻药物的副作用。然而,微生物发酵得到的乙偶因通常是两种手性异构体的混合物,需要经过工艺复杂的手性拆分才能获得一定旋光度的手性异构体,由于(r)-乙偶姻和(s)-乙偶姻的物理化学性质相近,手性拆分十分困难,成本高昂,极大地限制了手性乙偶姻的应用。

目前报道的纯酶催化法合成(r)-乙偶姻需要破碎细胞和分离纯化酶,原料为高价的丁二酮或者光学纯meso-2,3-丁二醇,反应体系中还需要加入昂贵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,制备成本很高,无法实现商业化生产。crout等人报道利用培养的klebsiellaaerogenes,破碎细胞并提取乙酰羟酸合成酶(α-乙酰乳酸合成酶)、乙酰乳酸脱羧酶(α-乙酰乳酸脱羧酶),可以催化丙酮酸产生(r)-乙偶姻,但也存在工艺复杂、产量太低及原料丙酮酸成本过高的问题【journalofthechemicalsociety,perkintransactions1,1986,105-108】。全细胞催化法合成(r)-乙偶姻需要使用高价原料如光学纯(r,r)-2,3-丁二醇【actabiotechnologica,2002,22:355-362;plosone,2010,5:e8860;中国发明专利:200910013902.8】、光学纯meso-2,3-丁二醇【journalofmicrobiologyandbiotechnology,2017,27:92-100】,或者丁二酮【中国发明专利:201410341765.1】,原料成本非常高,无法实现商业化生产。

1984年,ui等报道了利用pseudomonassp.s-4发酵法合成单一构型(r)-乙偶姻【journaloffermentationtechnology,1984,62:151-156】,该法存在产物浓度低(1.72g/l)和发酵周期长(48h)的问题。此外,研究者对丁二醇高产菌株klebsiellapneumoniae、serratiamarcescens进行了改造获得积累(r)-乙偶姻的工程菌株【journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2015,42:779-786;journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2015,42:1105-1115;中国发明专利:201310346916.8;中国发明专利:201510033927.x】,然而,k.pneumoniae、s.marcescens被世界卫生组织列为致病菌株(riskgroup2,pathogenicmicroorganisms),大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了其应用【biotechnologyadvances,2009,27:715-725;appliedandenvironmentalmicrobiology,2011,77:5467-5475;bioresourcetechnology,2012,124:237-244】。

也有研究者尝试在安全模式微生物escherichiacoli中构建人工合成途径来制备(r)-乙偶姻。1998年,ui等将k.pneumoniae编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶导入e.coli中,获得的重组大肠杆菌可以发酵葡萄糖产生(r)-乙偶姻【lettersinappliedmicrobiology,1998,26:275-278】。然而,糖酵解产生丙酮酸的过程中会产生大量的还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh),而由丙酮酸生成(r)-乙偶姻并没有消耗过量的nadh,无法实现氧化型辅酶nad+的有效再生,导致(r)-乙偶姻的产量太低(17.5g/l)。xu等克隆serratiamarcescens包含budr、buda、budb的dna片段,将其插入puc19表达质粒中获得重组质粒puc-ac,其中buda和budb形成一个操纵子,与转录调控因子编码基因budr间隔450bp。将lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因nox插入puc-ac获得pac-nox,并将其导入e.colidh5α中获得工程菌株e.coli(pac-nox),补料分批发酵(r)-乙偶姻产量为60.3g/l。该法需要添加乙酸钠来解除budr编码的转录调控因子budr对buda、budb转录的抑制【journalofchemicaltechnologyandbiotechnology,2015,90:93-100】。外源添加乙酸钠不但增加原料成本,而且乙酸钠会破坏细胞跨膜质子梯度,对菌体的生长和发酵不利【生物工程学报,2000,16:528-530;生物技术通报,2009,10:66-69】。另一方面,该法使用的丰富培养基主要成分为高纯糖(葡萄糖)和高价氮源(酵母粉),将极大地提高商业化生产的原料成本。



技术实现要素:

本发明针对现有合成(r)-乙偶姻技术存在原料成本过高、(r)-乙偶姻产量太低、氧化型辅酶nad+不能有效再生,或者菌株具有致病性等诸多问题,提供一种生产(r)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用。本发明通过构建多顺反子表达载体,再导入宿主菌e.coli,获得生产(r)-乙偶姻的基因工程菌株,由于在胞内构建氧化型辅酶nad+的有效再生系统,实现了(r)-乙偶姻高效合成与nad+再生相偶联。同时还使用代谢工程技术对代谢网络进行优化,敲除主要副产物合成途径的关键基因,提高(r)-乙偶姻的产量、光学纯度与转化率。本发明还提供利用非粮木薯粉和廉价氮源作为发酵原料生产(r)-乙偶姻的工艺,代替高纯糖和高价氮源,可大幅降低原料成本。

为了实现以上目的,本发明采用的技术方案如下:

一种生产(r)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法,包括以下步骤:(1)将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和nadh氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化;(2)将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和nadh氧化酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇;(3)将基因簇插入表达载体中,获得多顺反子重组质粒;(4)将多顺反子重组质粒导入宿主菌e.coli,获得生产(r)-乙偶姻的基因工程菌株。

进一步地,所述经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和nadh氧化酶基因的核苷酸序列前面添加了含核糖体结合位点和间隔序列的核苷酸序列taaggaggatataca。

在细胞内,核糖体负责将mrna翻译成蛋白质,16srrna是核糖体的一个亚基,它可与核糖体结合位点通过碱基互补原则精确识别,在基因前面添加taaggaggatatac序列,可以增强核糖体与mrna的识别与结合能力,而适当的间隔序列也可以提高翻译效率,在相同的转录水平下,提高了α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和nadh氧化酶的活力,酶促反应加快,最终提高(r)-乙偶姻的合成能力。

进一步地,所述e.coli为多基因缺失的突变菌株,通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得;所述副产物包括(s)-乙偶姻、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸;所述合成副产物的关键基因包括dar、glda、frdabcd、ldha和pta。

进一步地,所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株选自enterobactercloacae、klebsiellapneumoniae、klebsiellaoxytoca、enterobacteraerogenes、serratiamarcescens、paenibacilluspolymyxa和bacilluslicheniformis。

所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株优选enterobactercloacae、klebsiellapneumoniae、serratiamarcescens。

进一步地,所述的nadh氧化酶基因的来源菌株选自lactococcuslactis、lactobacillusbrevis、lactobacillusrhamnosus、streptococcuspyogenes、bacillussubtilis和clostridiumaminovalericum。

所述的nadh氧化酶基因的来源菌株优选lactococcuslactis、lactobacillusbrevis、streptococcuspyogenes和bacillussubtilis。

本发明还提供所述基因工程菌株在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)发酵培养基的制备:取木薯粉、氮源原料,再加入水、液化酶和氯化钙,在80-100℃下液化0.5-5h,静置冷却;当温度降低至55℃以下时,加入糖化酶和蛋白酶,在50-60℃糖化5-20h,调节ph6.5-7.5,离心或过滤收集上清,稀释上清液后在115℃条件下灭菌15min,即得;按1000ml水计,所述液化和糖化的各组分用量为:木薯粉100-200g,氮源原料40-80g,液化酶0.5-2ml,氯化钙0.01-0.5g,糖化酶0.2-1ml,蛋白酶0.05~0.5g;所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得,所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或一种以上组合;

(2)在无菌条件下,在发酵培养基中添加50-100μg/ml氨苄青霉素,然后移至发酵罐中,将经活化的基因工程菌菌液以体积比为1-10%的接种量接种到发酵培养基中,在温度35-42℃、搅拌转速200-800rpm、通气量0.5-1.5vvm条件下发酵培养20-72h,当检测发酵液中(r)-乙偶姻的浓度不再增加时,发酵结束。

所述氮源原料优选棉籽蛋白粉、豆粕粉;所述发酵培养温度优选37-40℃,搅拌转速优选500-600rpm,通气量优选0.5-1.0vvm。

在液化和糖化过程中,使用液化酶和糖化酶单独水解木薯粉,浓缩后可得到木薯还原糖母液。

进一步地,所述基因工程菌菌液的制备方法,包括以下步骤:(1)将生产(r)-乙偶姻基因工程菌株划线到含有质量体积比为1.8%琼脂和含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,在37℃培养10-15h;在无菌的条件下,挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体种子培养基中,37℃摇床震荡培养10-15h;所述lb培养基的配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

进一步地,在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度,当葡萄糖浓度降至10-30g/l时,补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/l;所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800g/l。

与现有技术相比,本发明的有益及有益效果为:

1、本发明提供的生产(r)-乙偶姻工程菌株能有效利用来源广泛、成本低廉的原料,菌株无致病性,氧化型辅酶nad+能够有效再生,菌株的(r)-乙偶姻产量、光学纯度和生产效率高,最高产量可达到72.1g/l,光学纯度可达99%以上,克服了现有技术存在的问题。

2、本发明菌株的构建方法具有操作简便、效率高、成本低廉等优点,容易实现工业化生产。

3、本发明利用代谢工程敲除基因工程菌株中合成副产物的关键基因,提高了(r)-乙偶姻产量的产量和收率,同时副产物浓度的降低有利于(r)-乙偶姻的下游提取,能够降低下游成本。

4、基于载体ptrc99a等的基因表达无需添加具有毒性并且成本较高的诱导剂iptg,工程菌株的外源基因表达水平即可满足高效合成(r)-乙偶姻的需要,同时由于不需要表达转录调控因子,因此培养基中无需添加具有细胞毒性的乙酸(盐)解除转录抑制,降低了生产成本,同时避免基因过量表达产生的代谢负荷,工程菌株性质稳定。

5、本发明利用非粮木薯粉为碳源,棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源,替代已有报道使用的高纯糖、酵母粉用于发酵生产(r)-乙偶姻,不仅可以提高这些廉价原料的综合利用价值,还为(r)-乙偶姻发酵提供了更加廉价的原料,可大幅降低(r)-乙偶姻发酵的原料成本。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步详细说明,但不限于本发明的保护范围。

下述实施例中所涉及的材料:(1)液化酶、糖化酶、蛋白酶为商业化产品,可购于诺维信(中国)生物技术有限公司等公司;(2)棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉为商业化产品,可购于青岛科瑞培养基有限公司等公司。

下述实施例在发酵生产(r)-乙偶姻过程中,采用sba-40c分析仪检测发酵液中葡萄糖浓度,利用液相色谱测定主要副产物的浓度,利用气相色谱测定产物(r)-乙偶姻的浓度及光学纯度,(r)-乙偶姻光学纯度的计算方法:ee=([r])/([r]+[s])×100%。

实施例1

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra1的构建:

将来源于enterobactercloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budb、α-乙酰乳酸脱羧酶基因buda和来源于lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因noxe的核苷酸序列进行密码子优化,在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列taaggaggatataca,然后利用人工合成的方法获得基因簇budb-buda-noxe,其核苷酸序列长度为3849个碱基,核苷酸序列如seqidno.1所述。利用双酶切与连接的方法,将基因簇budb-buda-noxe插入质粒ptrc99a的启动子后面,获得多顺反子重组质粒ptrc99a-budb-buda-noxe,再将重组质粒ptrc99a-budb-buda-noxe导入宿主菌e.colimg1655,获得产(r)-乙偶姻的基因工程菌株ecra1。

实施例2

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra2的构建:

对paenibacilluspolymyxadsm365的基因组序列进行分析,获得该菌株的α-乙酰乳酸合成酶基因alss、α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsd的核苷酸序列。alss基因核苷酸序列长度为1701个碱基,核苷酸序列如seqidno.2所述;alsd基因核苷酸序列长度为747个碱基,核苷酸序列如seqidno.3所述。对alss、alsd和noxe的核苷酸序列进行密码子优化,在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列taaggaggatataca,然后利用人工合成的方法获得基因簇alss-alsd-noxe,其核苷酸序列长度为3837个碱基,核苷酸序列如seqidno.4所述。再将基因簇alss-alsd-noxe插入质粒ptrc99a的启动子后面,获得多顺反子重组质粒ptrc99a-alss-alsd-noxe,将其导入宿主菌e.colimg1655,获得产(r)-乙偶姻的基因工程菌株ecra2。

实施例3

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra3的构建:

通过分析发现工程菌株ecra1和ecra2发酵的副产物为(s)-乙偶姻、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸,其合成途径的关键基因是dar、glda、frdabcd、ldha和pta。利用大肠杆菌λ噬菌体来源的red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理,先用两侧带有frt位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因,再通过诱导外源性温敏质粒表达flp重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的,具体步骤如下:

将pkd46质粒转化入宿主细胞,制备电转化感受态细胞;利用引物进行pcr构建打靶序列(含氯霉素抗性基因),并将其直接转化入含pkd46的宿主细胞;氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆;利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆,制备电转化感受态细胞;电转导入pcp20质粒删除氯霉素抗性基因;氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次,制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除,可获得多基因缺失的突变株e.colimg1655/δdarδgldaδfrdabcdδldhaδpta,制备电转化感受态细胞,实施例1构建的多顺反子重组质粒ptrc99a-budb-buda-noxe电转导入多基因缺失突变株,获得工程菌株ecra3。

表1各引物的核苷酸序列

实施例4

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra4的构建:

本实施例与实施例1的不同之处是:α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为klebsiellapneumoniae,nadh氧化酶基因的来源菌株为lactococcuslactis。

实施例5

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra5的构建:

本实施例与实施例3的不同之处是:将实施例4构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株,获得工程菌株ecra5。

实施例6

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra6的构建:

本实施例与实施例1的不同之处是:α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为serratiamarcescens,nadh氧化酶基因的来源菌株为streptococcuspyogenes。

实施例7

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra7的构建:

本实施例与实施例3的不同之处是:将实施例6构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株,获得工程菌株ecra7。

实施例8

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra8的构建:

本实施例与实施例1的不同之处是:α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为enterobacteraerogenes,nadh氧化酶基因的来源菌株为bacillussubtilis,宿主菌为e.colibw25113。

实施例9

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra9的构建:

本实施例与实施例1的不同之处是:α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为klebsiellaoxytoca,nadh氧化酶基因的来源菌株为lactobacillusrhamnosus,宿主菌为e.colibw25113。

实施例10

生产(r)-乙偶姻基因工程菌株ecra10的构建:

本实施例与实施例1的不同之处是:α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为bacilluslicheniformis,nadh氧化酶基因的来源菌株为clostridiumaminovalericum。

实施例3-10合成基因簇的方法与实施例1或2相同,或为现有常规技术方法,本领域技术人员能够通过本申请公开的内容获悉该基因簇的核苷酸序列,对此不再累述实施例3-10对应合成的基因簇的核苷酸序列。

应用实施例1

工程菌株ecra1、ecra2、ecra3、ecra4、ecra5、ecra6、ecra7、ecra8、ecra9、ecra10在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为100目的木薯粉;称取木薯粉180g十份,分别加入烧杯中,每份再各补加入60g棉籽蛋白粉、1000ml自来水、0.5ml液化酶和0.2g氯化钙,充分摇匀后,95℃液化1.5h,静置冷却;温度降低至55℃以下时,加入0.5ml糖化酶和0.1g蛋白酶,在55℃糖化20h,调节ph7.5,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素,分别取500ml转移至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取活化好的ecra1、ecra2、ecra3、ecra4、ecra5、ecra6、ecra7、ecra8、ecra9、ecra10工程菌菌液以体积比为5%的接种量分别接种到上述发酵培养基中,其中ecra9、ecra10添加0.01mm的iptg,然后在温度37℃、搅拌转速300rpm、通气量1vvm条件下发酵培养,发酵16h、28h分别补糖50g/l,至(r)-乙偶姻浓度不再增加时结束发酵,取样并利用气相色谱和液相色谱测定产物(r)-乙偶姻及副产物(s)-乙偶姻、丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸的浓度,并计算(r)-乙偶姻的光学纯度,测定结果如表1所示。

所述工程菌菌液的活化方法:将生产(r)-乙偶姻的ecra1、ecra2、ecra3、ecra4、ecra5、ecra6、ecra7、ecra8、ecra9、ecra10工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养12h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养10h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

表2不同工程菌株的发酵产物

从表2可以得知,敲除副产物合成途径的关键基因dar、glda、frdabcd、ldha和pta,工程菌株ecra3、ecra5、ecra7的(r)-乙偶姻产量和光学纯度,与未经过敲除处理的工程菌株(分别对应于ecra1、ecra4、ecra6)相比显著提高,(r)-乙偶姻的副产物2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸的浓度大大降低,因此敲除副产物合成途径的关键基因不但提高了(r)-乙偶姻产量和光学纯度,而且有利于下游的产物提取,能够降低生产成本并提高产品的质量(光学纯度高)。

应用实施例2

工程菌株ecra3在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为100目的木薯粉;称取木薯粉190g四份,分别加入烧杯中,再分别加入57g豆粕粉、70g豆饼粉、62g花生蛋白粉、70g棉籽蛋白粉,再加入1000ml自来水、1.2ml液化酶和0.5g氯化钙,充分摇匀后,90℃液化2h,静置冷却;温度降低至50℃以下时,加入0.3ml糖化酶和0.2g蛋白酶,在55℃糖化24h,调节ph6.5,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中100μg/ml氨苄青霉素,分别取500ml添加至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取经活化的ecra3工程菌菌液以体积比为10%的接种量接种到上述发酵培养基中,在温度40℃、搅拌转速600rpm、通气量1.0vvm条件下发酵培养,发酵12h和24h分别补糖50g/l,发酵液中(r)-乙偶姻的浓度不再增加时发酵结束。经过测定豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉、棉籽蛋白粉对应的(r)-乙偶姻产量分别是58.1g/l、63.6g/l、61.5g/l、72.1g/l,光学纯度分别为99.1%、99.3%、99.2%、99.4%。

所述ecra3工程菌菌液的活化方法:将ecra3工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养15h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养12h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

应用实施例3

工程菌株ecra5在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为150目的木薯粉;称取木薯粉185g,加入烧杯中,再加入65g棉籽蛋白粉,再加入1000ml自来水、0.8ml液化酶和0.3g氯化钙,充分摇匀后,95℃液化2h,静置冷却;温度降低至55℃以下时,加入0.8ml糖化酶和0.3g蛋白酶,在55℃糖化18h,调节ph7.0,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素,取500ml转移至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取经活化的ecra5工程菌菌液以体积比为8%的接种量接种到上述发酵培养基中,在温度37℃、搅拌转速500rpm、通气量0.7vvm条件下发酵培养15h后,发酵液中葡萄糖浓度下降为23.7g/l,补糖50g/l,发酵25h后再次补加等量木薯还原糖母液,发酵45h后,(r)-乙偶姻产量为65.2g/l,光学纯度达到99.5%。

所述ecra5工程菌菌液的活化方法:将ecra5工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养10h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养15h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

应用实施例4

工程菌株ecra6在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为60目的木薯粉;称取木薯粉120g,加入烧杯中,再加入40g豆粕粉,再加入1000ml自来水、1.8ml液化酶和0.03g氯化钙,充分摇匀后,85℃液化5h,静置冷却;温度降低至55℃以下时,加入0.2ml糖化酶和0.08g蛋白酶,在60℃糖化6h,调节ph7.0,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中添加60μg/ml氨苄青霉素,取500ml转移至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取经活化的ecra6工程菌菌液以体积比为2%的接种量接种到上述发酵培养基中,在温度42℃、搅拌转速300rpm、通气量1.3vvm条件下发酵培养16h后,发酵液中葡萄糖浓度下降为28.3g/l,补糖40g/l,发酵32h后再次补加等量木薯还原糖母液,发酵48h后,(r)-乙偶姻产量为46.7g/l,光学纯度达到99.1%。

所述ecra6工程菌菌液的活化方法:将ecra6工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养12h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养12h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

应用实施例5

工程菌株ecra7在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为200目的木薯粉;称取木薯粉150g,加入烧杯中,再加入20g豆粕粉、20g棉籽蛋白粉和25g花生蛋白粉,再加入1000ml自来水、1.2ml液化酶和0.25g氯化钙,充分摇匀后,100℃液化1h,静置冷却;温度降低至55℃以下时,加入1ml糖化酶和0.1g蛋白酶,在50℃糖化20h,调节ph7.0,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中添加80μg/ml氨苄青霉素,取500ml转移至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取经活化的ecra7工程菌菌液以体积比为5%的接种量接种到上述发酵培养基中,在温度37℃、搅拌转速700rpm、通气量0.5vvm条件下发酵培养16h后,发酵液中葡萄糖浓度下降为15.8g/l,补糖70g/l,发酵32h、48h、64h后再次补加等量木薯还原糖母液,发酵72h后,(r)-乙偶姻产量为65.5g/l,光学纯度达到99.3%。

所述ecra7工程菌菌液的活化方法:将ecra7工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养10h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养15h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

应用实施例6

工程菌株ecra8在生产(r)-乙偶姻的应用,包括以下步骤:

(1)将木薯去皮晒干后,粉碎至粒径为100目的木薯粉;称取木薯粉150g,加入烧杯中,再加入50g棉籽蛋白粉和30g花生蛋白粉,再加入1000ml自来水、1.0ml液化酶和0.2g氯化钙,充分摇匀后,90℃液化3h,静置冷却;温度降低至55℃以下时,加入0.5ml糖化酶和0.25g蛋白酶,在55℃糖化12h,调节ph7.0,离心收集上清,用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l,在115℃条件下灭菌15min,即得发酵培养基;

(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素,取500ml转移至上海百仑六联发酵罐,在无菌条件下,取经活化的ecra8工程菌菌液以体积比为8%的接种量接种到上述发酵培养基中,在温度38℃、搅拌转速500rpm、通气量1.2vvm条件下发酵培养16h后,发酵液中葡萄糖浓度下降为20.3g/l,补糖40g/l,发酵32h、48h后再次补加等量木薯还原糖母液,发酵60h后,(r)-乙偶姻产量为61.1g/l,光学纯度达到99.5%。

所述ecra8工程菌菌液的活化方法:将ecra8工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8%琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上,37℃培养15h;在无菌的条件下,用牙签挑取lb平板上的一个单菌落,然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中,37℃摇床震荡培养10h;所述的lb培养基配方为:10g/l蛋白胨,5g/l酵母粉,10g/l氯化钠。

sequencelisting

<110>广西科学院

<120>生产(r)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用

<130>3849

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3849

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

taaggaggatatacatatgaactcggagaaacagtcgcgccaatgggcgcatggcgccga60

catggttgtgggccaactggaagcccagggcgtgaagcaggtgtttggcatcccgggcgc120

gaaaattgacaaggtgtttgactcgctgctggatagcagcattgagatcattcctgtgcg180

ccatgaggcgaacgccgcctttatggccgccgcggttggtcgtctgaccggtaaggccgg240

cgtggccttagtgaccagcggtcctggttgttctaatctgattaccggcattgcgaccgc300

gaactcggagggcgatcctgtggtggccttaggcggtgcggttaagcgcgcggataaagc360

caaactggtgcaccagagcatggataccgtggcgatgtttagcccggtgacgaagtacgc420

cgttgaagttagctcgccggacgcgattgcggaggtggttagcaacgcgtttcgtgccgc480

ggaacatggccgtcctggtggcgcgttcgtttcgctgccgcaggacattgttgatcagcc540

tgcgaccggtgcgatcttaccggccagcggtcctgccctgatgggtccggcccctgaaag600

cgcgatcaatgatgttgcgaaattaattgacaatgcgaaaaacccggtgattctgctggg660

cttaatggcctcgcagcctgccaatagcgcggcgttacgcaaactgctggagaagagccg720

tattccggtgacttctacttaccaagccgccggcgcggtgaatcaggaacactttacccg780

ctttgccggtcgcgtgggtctgttcaacaatcaagcgggtgaccgcctgttacacctggc840

ggatctgatcatttgcattggctacagcccggttgaatacgaaccgagcatgtggaacag900

cggcgatgccacgctggtgcatatcgatgttctgcctgcgtacgaggaacgcaattatgt960

gccggatatcgagctggtgggtgacattgccgcgaccctgaatttactggcctcgcgtat1020

tgaccacaagctggaactgagccaacgcgcgtcggagattctggtggaccgccaacatca1080

gcgcgatttattagaccgccgtggtgcgtcgctgaaccagtttgcgctgcatcctctgcg1140

cattgttcgcgcgatgcaggatatcgtgaacaacgatgtgaccctgaccgtggacatggg1200

cagcttccatatctggatcgcgcgttatctgtacagcttccgcgcccgtcaggtgatgat1260

cagcaacggccagcagactatgggtgttgccttaccgtgggcgatcggcgcgtggctggt1320

taacccgggtcgtaaggttgtgagcgtgtcgggcgatggcggtttcttacagagcagcat1380

ggagctggaaacggccgtgcgcctgaacgccaacgtgttacatattatttgggtggataa1440

cggctataacatggtggccatccaagaggagaagaagtatcagcgcctgagcggtgttgc1500

gtttggcccggtggatttcaaggcctatgcggatgcctttggcgcccgtggcttcgccgt1560

ggaaagcgccgatgcgttagaaagcaccctgcgcgcggctatggatgttaatggtccggc1620

ggttgttgcgattccggtggattacagcgataacccgctgctgatgggccagctgcatct1680

gtcgcagattctgtaataaggaggatatacatatgatgcacagctcggcgtgcgattgtg1740

aagcgtcgctgtgcgaaaccctgcgcggctttagcgccaaacatccggacagcgttatct1800

accagacctcgctgatgagcgcgctgctgtcgggcgtttacgaaggcgacaccacgatcg1860

ccgatctgctggctcatggtgatttcggtctgggcaccttcaacgaactggacggcgaaa1920

tgattgccttttcttctcaggtgtaccagttacgcgccgacggcagcgcgcgcgcggcca1980

aaccggaacagaaaacgccgttcgccgtgatgacgtggttccaaccgcagtatcgcaaaa2040

cgtttgatgccccggtttcgcgtcagcagattcatgacgtgatcgatcagcagattccga2100

gcgacaacctgttctgcgcgctgcgcattgacggcaattttcgccacgcccacacccgca2160

cggttcctcgccaaacgccgccgtaccgtgccatgaccgatgtgctggacgaccagccgg2220

tgtttcgttttaaccaacgcgaaggcgtgctggttggcttccgcacgccgcagcacatgc2280

agggcattaatgttgccggctaccatgagcactttattaccgacgatcgccagggcggcg2340

gtcatttactggattatcagctggagagcggtgtgctgaccttcggcgagattcacaaac2400

tgatgatcgacctgccggccgacagcgccttcttacaagcgaatctgcacccgagcaacc2460

tggacgccgcgattcgttcggtggaaaattaataaggaggatatacatatgaaaatcgtt2520

gttatcggtaccaaccacgctggtatcgctaccgctaacaccctgctggaacagtacccg2580

ggtcacgaaatcgttatgatcgaccgtaactctaacatgtcttacctgggttgcggtacc2640

gctatctgggttggtcgtcagatcgaaaaaccggacgaactgttctacgctaaagctgaa2700

gacttcgaagctaaaggtgttaaaatcctgaccgaaaccgaagtttctgaaatcgacttc2760

gctaacaaaaaagtttacgctaaaaccaaatctgacgacgaaatcatcgaagcttacgac2820

aaactggttctggctaccggttctcgtccgatcatcccgaacctgccgggtaaagacctg2880

aaaggtatccacttcctgaaactgttccaggaaggtcaggctatcgacgctgaattcgct2940

aaagaaaaagttaaacgtatcgctgttatcggtgctggttacatcggtaccgaaatcgct3000

gaagctgctaaacgtcgtggtaaagaagttctgctgttcgacgctgaaaacacctctctg3060

gcttcttactacgacgaagaattcgctaaaggtatggacgaaaacctggctcagcacggt3120

atcgaactgcacttcggtgaactggctaaagaattcaaagctaacgaagaaggttacgtt3180

tctcagatcgttaccaacaaagctacctacgacgttgacctggttatcaactgcatcggt3240

ttcaccgctaactctgctctggcttctgacaaactggctaccttcaaaaacggtgctatc3300

aaagttgacaaacaccagcagtcttctgacccggacgtttacgctgttggtgacgttgct3360

accatctactctaacgctctgcaggacttcacctacatcgctctggcttctaacgctgtt3420

cgttctggtatcgttgctggtcacaacatcggtggtaaagaactggaatctgttggtgtt3480

cagggttctaacggtatctctatcttcggttacaacatgacctctaccggtctgtctgtt3540

aaagctgctaaaaaactgggtctggaagtttctttctctgacttcgaagacaaacagaaa3600

gcttggttcctgcacgaaaacaacgactctgttaaaatccgtatcgtttacgaaaccaaa3660

tctcgtcgtatcatcggtgctcagctggcttctaaatctgaaatcatcgctggtaacatc3720

aacatgttctctctggctatccaggaaaaaaaaaccatcgacgaactggctctgctggac3780

ctgttcttcctgccgcacttcaactctccgtacaactacatgaccgttgctgctctgaac3840

gctaaataa3849

<210>2

<211>1701

<212>dna

<213>paenibacilluspolymyxadsm365

<400>2

ttgagtaccaaagttcaagctgttcaaactaaaactaaaaccaaatccgatacaaaagga60

gccgaccttgttgtcgattgtttgatcaagcaaggggttacgcatatttttggcattcca120

ggtgccaagatcgattctgtttttgatgttcttcaagatcggggtccagaattgatcata180

tgccgtcatgaacaaaatgccgcctttatggcagcagcggtcggtcgtttaacaggtaaa240

ccgggcgtatgcattgttacttccggtccaggcgcgtctaacttggcgacaggacttgtc300

accgctaatgcagagagtgatcctgtcgtcgccattgctggtgcagtcccaagatcagaa360

cgcctgaaacgcacgcatcaatctatggataacgccggacttttcgaacccatcaccaag420

tacagtgtagaagtagaacatcctgatagtgtaccggaagcaattactaatgcatttcgg480

attgcgacctcagcccagcctggagccacatttgtcagtctgccgcaggacgtgttgact540

tcgtcatccgaagtaaccgccattgagaaggtttcccttccccagcttggaaccgcaccc600

gccgagctcatcaaacaagttgcaggccaaatcaaaaaagccaagctgcccgtactcctt660

ctcggtatgaaagccagcacacccgaagctacagcagccatccgtgcactgattcgaaac720

acggatttgcctgtggttgaaacctttcaggccgctggagccatttcccgggagctggaa780

agccactattttgggagagtcggtctgttccataatcagccgggtgacatgcttcttgga840

gcggcagatctggtactgacgattggctatgatcctattgaatatgatccaaaaaactgg900

aatattcctgcgaaccgaacccttattcatctggatgatcatcaagcagatattgatcat960

gattatcaacctgatcacgagcttatcgggaatatagccctgattgtgagtggccttgca1020

gaagaattgcctaccttaaagctacctaaagcctcctgcgaccaattaaatcgtcttcgt1080

catgatctaaacgagcaagaagctgttcctgtacacagtcacgattatctgattcatcca1140

ttacaatttattcgtacactgcgcagcctgatcgacgataatgtcactgtcacctgtgat1200

gttggttcacactacatttggatggcacgatatttccgttcgtatgaaccgcggcgcctt1260

ctattcagcaacggaatgcagacgttgggcgtagcactgccttgggggattgctgccaca1320

ctcgtcaaccccggtcaaaaagtcgtttctatttctggagacggaggatttctgttttca1380

tccatggagctcgaaaccgctgtacgtcttaactctccgctagtgcatatcgtatggaga1440

gatggtacctatgacatggtcgcatttcaacaacagattaaatatggcagaacttccggt1500

gtaaaatttggagatgttgatgtagtgaaatatgctgaaagcttcggggccaccggatta1560

cgcgtgcactctcctgaagaactggaaagtgtattgcagcaggcacttcatacggatggt1620

cctgtggttgttgatatcccgattaattatcaagataatatccagttgggacgtaaactg1680

ctgccaaatcaattaaactaa1701

<210>3

<211>747

<212>dna

<213>paenibacilluspolymyxadsm365

<400>3

atgaccgttgcaggactggaaaccaagcaagaaactgaccatgatatttaccaaacgtcc60

actatgctcgctctattagatggtctttatgacggagttgttgcctttgaggagttgcaa120

aagcacggggattttgggattggtacctttgatcaactgaatggcgagatgatcgcgttc180

gatggtgaattctatcacttgcttccagacggtacggcccatcgcgtaaaaccggaagaa240

accacacctttttccaccgtcacctttttccatgaagatttcacatatactattgaccgt300

cccatgcatcgtgaagagctggaagctctgctgttaaagttgtttccaagccgtaatctg360

ttctatgccttccgtatggatggcacttttcgtgaagtaaagacacgtaccgtccctcac420

caggtgaagccttacaaaccttttatcgaagcgaccaaatctcagcctacgttctctttt480

aacgacgcttctggggtgattacaggtttttggacacctgcctatgctcaaggtattggg540

gtagccggatttcatctgcattttattaacgatgaacgcactgggggtgggcatgtcttt600

gattttatcgtcgaaaagtgcaccatccgcatttgtcaaaaatccaatctgcacctggtc660

ctgcccgataccccggattacttgaaggccaacctgtccagagaaaacctggagaaggaa720

atcgccgttactgaaggtgcgcagtaa747

<210>4

<211>3837

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

taaggaggatatacatatgtccaccaaagttcaagcggtccagaccaaaacgaaaaccaa60

atcagatacgaaaggtgccgacctggtggttgattgcctgatcaaacagggcgttaccca120

tatttttggcatcccgggtgcgaaaattgactctgtgttcgatgttctgcaagaccgcgg180

tccggaactgattatctgccgtcacgaacagaatgccgcatttatggcagctgcggtggg240

ccgcctgaccggtaaaccgggtgtctgtattgtgacgtctggcccgggtgcaagtaacct300

ggctacgggtctggttaccgccaatgcagaaagcgatccggttgtggctatcgcgggtgc360

cgtgccgcgttccgaacgcctgaaacgtacccatcagtcaatggataacgcgggtctgtt420

cgaaccgattacgaaatattctgttgaagtcgaacacccggacagtgtgccggaagcgat480

cacgaatgcctttcgtatcgccaccagcgcacaaccgggtgcaaccttcgtcagcctgcc540

gcaggatgtgctgaccagcagcagcgaagttaccgcgattgaaaaagtctcgctgccgca600

gctgggcaccgcaccggctgaactgatcaaacaagtcgcaggccagattaagaaagcgaa660

actgccggtgctgctgctgggtatgaaagcaagcacgccggaagctaccgccgcaatccg720

cgcgctgattcgtaacaccgatctgccggttgtcgaaaccttccaggctgcgggcgcaat780

ctcccgcgaactggaatcacattattttggccgtgttggtctgttccacaatcagccggg840

tgatatgctgctgggcgccgcagacctggtgctgaccatcggttatgatccgattgaata900

cgacccgaaaaactggaatatcccggcaaaccgcacgctgattcatctggatgaccacca960

agctgatattgaccatgattaccagccggatcacgaactgattggtaatatcgcgctgat1020

tgtgtctggcctggccgaagaactgccgaccctgaaactgccgaaagcaagttgcgatca1080

actgaaccgtctgcgccatgacctgaatgaacaggaagctgtgccggttcatagccacga1140

ttatctgatccacccgctgcaatttattcgcaccctgcgttcgctgatcgatgacaacgt1200

cacggtgacctgtgatgtgggtagccattacatttggatggcgcgctattttcgttctta1260

cgaaccgcgtcgcctgctgttcagtaacggtatgcaaaccctgggcgttgcactgccgtg1320

gggtatcgctgcgacgctggtcaatccgggtcagaaagtggtttcgattagcggcgatgg1380

cggttttctgttctcctcaatggaactggaaaccgcagttcgcctgaatagtccgctggt1440

tcatatcgtctggcgtgatggcacctatgacatggtggccttccagcaacagattaaata1500

cggccgcacgtccggtgtgaaatttggcgacgttgatgtcgtgaaatatgcggaatcatt1560

cggtgcaaccggtctgcgtgtgcatagcccggaagaactggaaagcgttctgcaacaggc1620

gctgcacaccgatggtccggttgtcgtggacattccgatcaactaccaagataatattca1680

gctgggccgtaaactgctgccgaaccagctgaattaataaggaggatatacatatgaccg1740

tggcgggtctggaaaccaaacaggaaacggatcatgacatttatcaaaccagtacgatgc1800

tggcgctgctggatggtctgtacgacggcgtggttgcctttgaagaactgcaaaaacacg1860

gtgattttggtattggcaccttcgaccaactgaacggtgaaatgatcgcgtttgatggcg1920

aattttatcatctgctgccggatggcaccgcacaccgtgtgaaaccggaagaaaccacgc1980

cgttttcgaccgttacgtttttccatgaagatttcacctacacgatcgaccgtccgatgc2040

accgcgaagaactggaagcactgctgctgaaactgtttccgagccgtaacctgttttatg2100

ctttccgcatggatggcaccttccgtgaagttaaaacccgcacggtcccgcatcaggtga2160

aaccgtacaaaccgtttattgaagcaaccaaaagccaaccgacgttttctttcaatgatg2220

ctagtggtgtcatcaccggcttttggacgccggcgtatgcccagggtattggcgtggcgg2280

gctttcatctgcacttcatcaacgatgaacgtaccggcggtggccatgttttcgatttca2340

tcgtcgaaaaatgcacgattcgcatctgtcagaaatccaatctgcacctggttctgccgg2400

ataccccggactacctgaaagccaacctgtcacgcgaaaatctggaaaaagaaatcgcag2460

tcacggaaggcgctcaataataaggaggatatacatatgaaaatcgttgttatcggtacc2520

aaccacgctggtatcgctaccgctaacaccctgctggaacagtacccgggtcacgaaatc2580

gttatgatcgaccgtaactctaacatgtcttacctgggttgcggtaccgctatctgggtt2640

ggtcgtcagatcgaaaaaccggacgaactgttctacgctaaagctgaagacttcgaagct2700

aaaggtgttaaaatcctgaccgaaaccgaagtttctgaaatcgacttcgctaacaaaaaa2760

gtttacgctaaaaccaaatctgacgacgaaatcatcgaagcttacgacaaactggttctg2820

gctaccggttctcgtccgatcatcccgaacctgccgggtaaagacctgaaaggtatccac2880

ttcctgaaactgttccaggaaggtcaggctatcgacgctgaattcgctaaagaaaaagtt2940

aaacgtatcgctgttatcggtgctggttacatcggtaccgaaatcgctgaagctgctaaa3000

cgtcgtggtaaagaagttctgctgttcgacgctgaaaacacctctctggcttcttactac3060

gacgaagaattcgctaaaggtatggacgaaaacctggctcagcacggtatcgaactgcac3120

ttcggtgaactggctaaagaattcaaagctaacgaagaaggttacgtttctcagatcgtt3180

accaacaaagctacctacgacgttgacctggttatcaactgcatcggtttcaccgctaac3240

tctgctctggcttctgacaaactggctaccttcaaaaacggtgctatcaaagttgacaaa3300

caccagcagtcttctgacccggacgtttacgctgttggtgacgttgctaccatctactct3360

aacgctctgcaggacttcacctacatcgctctggcttctaacgctgttcgttctggtatc3420

gttgctggtcacaacatcggtggtaaagaactggaatctgttggtgttcagggttctaac3480

ggtatctctatcttcggttacaacatgacctctaccggtctgtctgttaaagctgctaaa3540

aaactgggtctggaagtttctttctctgacttcgaagacaaacagaaagcttggttcctg3600

cacgaaaacaacgactctgttaaaatccgtatcgtttacgaaaccaaatctcgtcgtatc3660

atcggtgctcagctggcttctaaatctgaaatcatcgctggtaacatcaacatgttctct3720

ctggctatccaggaaaaaaaaaccatcgacgaactggctctgctggacctgttcttcctg3780

ccgcacttcaactctccgtacaactacatgaccgttgctgctctgaacgctaaataa3837

当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1