一种新型的15种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法与流程

本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种新型的用于15种人乳头瘤病毒亚型分型的试剂盒和方法。

背景技术：

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链dna病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(e区)、晚期转录区(l区)和非转录区(长控制区，lcr)。人乳头瘤病毒通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

对于感染生殖道和肛门的人乳头瘤病毒，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道人乳头瘤病毒感染具有普遍性，据统计70％～80％的女性在其一生中会有至少一次的人乳头瘤病毒感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型人乳头瘤病毒感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型人乳头瘤病毒dna的存在，其中人乳头瘤病毒16型、18型、45型和31型感染占80％。低危型人乳头瘤病毒一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。国家cfda也已经颁布了人乳头瘤病毒(hpv)核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则，说明人乳头瘤病毒检测具有十分重要的临床意义。

根据hpv的同源性，已发现120多种型别。目前，市场上已经存在一些对人乳头瘤病毒进行检测的试剂盒，但是这些试剂盒通常是借助于荧光或者膜杂交的方式完成检测。

纳米金探针法区分不同亚型的病毒的步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。但由于涉及到多种型别的区分，检测时复杂，耗时耗力。

同时，市场上尚没有将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合的人乳头瘤病毒分型方法，只需要普通的pcr循环仪器就能以较少的管数分型更多的人乳头瘤病毒亚型数，如以6管检测反应实现15种亚型的人乳头瘤病毒分型。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的提供一种15种hpv亚型的分型试剂盒和分型方法，其为将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合，在无需增加通量的情况下、实现以较少的检测反应管数(6管)区分15种的hpv亚型，这一方式在分型数量越多时所起到的作用就越显著。

实现以上目的的技术方案如下。

一种15种hpv亚型的分型试剂盒，包括以下至少5个检测管，其中，

第一管包含有对应的检测引物和针对5种型号的探针；

第二管包含有对应的检测引物和针对4种型号的检测探针，第二管中所针对的探针的型号只有一种与第一管中的型号相同；

第三管包含有对应的检测引物和针对5种型号的探针，第三管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同；

第四管包含有对应的检测引物和针对5种型号的检测探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同；

第五管包含有对应的检测引物和针对5种型号的检测探针，第五管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同。

在其中一个实施例中，还包括有第六管，所述第六管包含对应的检测引物和针对阳性对照的检测探针。

在其中一个实施例中，所述15种hpv亚型为6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、和58。

在其中一个实施例中，所述第一管包含11、16、31、35、43的检测探针；第二管包含6、16、52、53的检测探针；第三管包含31、33、45、52、58的检测针；第四管包含35、39、42、53、58的检测探针；第五管包含18、39、43、45、56的检测探针；第六管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针；或者所述第一管包含6、33、35、42、52的检测探针；第二管包含11、35、43、53的检测探针；第三管包含18、33、53、56、58的检测针；第四管包含31、39、43、52、58的检测探针；第五管包含16、31、42、45、56的检测探针；第六管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。

本发明所述分型试剂盒和检测方法，利用了一种对设施条件要求低、结果判读简单、成本低廉的新型体外诊断方法(纳米金可视化检测方法)，将数学排列组合的数学模型与体外诊断方法相结合，实现了高灵敏、低成本、闭管且简便的人乳头瘤病毒分型检测。

本发明具有以下有益效果：

采用本发明中人乳头瘤方法实现了不同学科的交叉，将数学排列组合的数学模型与体外诊断方法相结合实现快速、高灵敏、低成本且简便的人乳头瘤病毒分型检测。不仅整个检测无需使用荧光探针，试剂存放无需避光，不必担心荧光衰减的问题，因此存放条件更加稳定。

利用本发明中的分型方法和分型试剂盒能够在不增加检测反应通量的情况下，实现以较少的检测反应管数区分15种人乳头瘤病毒亚型，降低了操作的复杂度和检测成本。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1是实施例1中15种hpv亚型的分型试剂盒各管中亚型分布的示意图。

图2是实施例2中6管检测反应区分15乳头瘤病毒亚型的检测特异性结果。

图3是实施例3中6管检测反应区分15种人乳头瘤病毒亚型的检测灵敏度结果。

图4是实施例4中6管检测反应区分15种人乳头瘤病毒亚型的检测结果。

图5实施例5中6管反应区分15种人乳头瘤病毒亚型组合方式。

图6是实施例5中6管反应区分15种人乳头瘤病毒亚型的检测样本结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

本发明所述的一种新型人乳头瘤病毒亚型分型方法，通过一种特定的数列组合，实现以最少的管数尽可能多的分型人乳头瘤病毒亚型。借助于一种定性的纳米金探针法检测方法，将这种数学排列组合算法与分子诊断技术相结合，在不增加检测反应通量的情况下，实现以最少的反应管数区分更多的人乳头瘤病毒亚型，以降低检测操作难度和检测成本。这一方式在分型数量越多时所起到的作用就越显著。

以6管区分15亚型的人乳头瘤病毒为例，对本发明的检测原理进行描述。对于待检测的15亚型人乳头瘤病毒，其中，人乳头瘤病毒亚型可以是以下亚型6、11、16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82、40、42、43、54、61、70、72、81、55、62、64、67、69、71、73、83、84中的任意15种。

实施例115种hpv亚型的分型试剂盒

本实施例选择其中6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型。

本实施例所述15种hpv亚型的分型试剂盒，包括有以下五个检测管一个对照管，其中，

第一管包含有5种型号的检测引物和探针，具体为包含11、16、31、35、43的检测探针；第二管包含有4种型号的检测引物和探针，第二管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，具体为第二管包含6、16、52、53的检测探针；

第三管包含有5种型号的检测引物和探针，第三管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，具体地，第三管包含31、33、45、52、58的检测探针；

第四管包含有5种型号的检测引物和探针，第四管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，具体为第四管包含35、39、42、53、58的检测探针

第五管包含有5种型号的检测引物和探针，第五管中所针对的检测探针的型号只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，具体为第五管包含18、39、43、45、56的检测探针；

第六管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针，针对样本中的β-actin基因模板。具体请参见图1。

所述六管检测引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的检测探针如下：

名称序列(5’→3’)

管1引物组合

f1actgtggtagataccacmcgyagtacmaayatgwcseqidno.1

r1cataattgaaaaataaaytgtaaatcrwaytcytcseqidno.2

管2引物组合

f2actgtggtagataccacccgtagtacyaacwtkacseqidno.3

r2cataattgaaaaataaattgyamatcataytcytcseqidno.4

管3引物组合

f3actgtggtagataccacymgwagtacwaayttaacseqidno.5

r3cataattgaaaaataaaytgyarwtcataytcttcseqidno.6

管4引物组合

f4actgtggtagataccacyagraryachaacatgacseqidno.7

r4cataattgaaaaataaaytgtarttcatattcctcseqidno.8

管5引物组合

f5actgtggtagataccactcscagyaccaatytwwcseqidno.9

r5cataattgaaaaataaaytgcaaatcawattcctcseqidno.10

管6引物组合

f7ctgctgctatgcctcat；seqidno.11

r7tagaggacaaacgggcaacat；seqidno.12

亚型探针

hairpinprobe

gtggtactgcactcgtctcggttttccgagacgagtcctcggcgcgaatattgat

seqidno.29

金标记通用探针

aunp-1sh-aaaaaaaaatgattatcaseqidno.30

aunp-2accacaagacaaaaaaaa-shseqidno.31。

人乳头瘤分型分管检测方式还受到引物探针本身相互干扰的影响，检测过程中需要考虑到实际分型检测中的试剂干扰，通过本发明所设计的探针和引物，可以实现5管检测管对15种人乳头瘤病毒亚型分型。

实施例26管测反应区分15乳头瘤病毒亚型的检测特异性

本实施例中分别采用实施例1中所述15种hpv亚型的分型试剂盒的引物和探针配制反应液，总体积为20μl，每样本检测分为6管进行，每管的检测组分分别为：1μm引物、1μm探针和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u内切酶a，0.2mmdntp，分别向该体系中加入对应人乳头瘤病毒亚型的待测靶标分子，其浓度为10⁴拷贝，最后一管加入β-actin片段，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

本发明方法检测不同亚型的人乳头瘤病毒的步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。

反应结束后拍照，结果示于图2中。图2的结果显示，第一管包含11、16、31、35、43的检测探针，检测时分别加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的待检靶标分子，结果仅有11、16、31、35、43亚型呈现阳性；第二管包含6、16、52、53的检测探针，检测时分别加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的待检靶标分子，结果仅有6、16、52、53亚型呈现阳性；第三管包含31、33、45、52、58的检测针，检测时分别加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的待检靶标分子，结果仅有31、33、45、52、58亚型呈现阳性；第四管包含35、39、42、53、58的检测探针，检测时分别加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的待检靶标分子，结果仅有35、39、42、53、58亚型呈现阳性；第五管包含18、39、43、45、56的检测探针，检测时分别加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的待检靶标分子，结果仅有18、39、43、45、56亚型呈现阳性；第六管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针，该体系同时检测β-actin基因的靶标分子，结果均呈阳性。本发明试剂盒6管检测反应结果均与预期相符，分别能够特异性的检测出对应的人乳头瘤病毒亚型，表明检测特异性良好。

实施例3实施例1所述15种hpv亚型的分型试剂盒的检测灵敏度

本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μl，每样本检测分为6管进行，每管的检测组分分别为：1μm引物、1μm探针和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u内切酶a，0.2mmdntp，向该体系中分别加入10⁵、10⁴、10³、10²、10、1及0拷贝的不同亚型的待测靶分子，管1分别加入11、16、31、35、43亚型不同浓度的模板分子；管2分别加入6、16、52、53亚型不同浓度的模板分子；管3分别加入31、33、45、52、58亚型不同浓度的模板分子；管4分别加入35、39、42、53、58亚型不同浓度的模板分子；管5分别加入18、39、43、45、56亚型不同浓度的模板分子。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反应结束后拍照，结果示于图3中。图3的结果显示本发明试剂盒检测人乳头瘤病毒亚型的检测灵敏度，检测灵敏度可达到100-1000拷贝之间。

实施例4实施例1所述15种hpv亚型的分型试剂盒的检测临床样本结果

本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μl，每样本检测分为6管进行，每管的检测组分分别为：1μm引物、1μm探针和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u内切酶a，0.2mmdntp，向该体系中分别加入不同亚型的待测样本，其浓度为10⁴拷贝，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反应结束后拍照，结果示于图4中。图4的结果表明本发明试剂盒能够通过6管检测反应区分待检样本中15种人乳头瘤病毒亚型。

实施例56管检测反应区分15乳头瘤病毒亚型的区别于实施例1的组合方式及检测样本结果

本实施例中举例了另一种组合方式，所述第一管包含6、33、35、42、52的检测探针；第二管包含11、35、43、53的检测探针；第三管包含18、33、53、56、58的检测针；第四管包含31、39、43、52、58的检测探针；第五管包含16、31、42、45、56的检测探针；第六管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。具体如图5所示。

所述六管检测引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15种亚型的检测探针与实施例1相同。

本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μl，按照图5的组合方式，每样本检测分为6管进行，每管的检测组分分别为：1μm引物、1μm探针和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u内切酶a，0.2mmdntp，向该体系中分别加入不同亚型的待测样本，其浓度为10⁴拷贝，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反应结束后拍照，结果示于图6中。图6的结果表明本发明试剂盒能够通过6管检测反应区分待检样本中15种人乳头瘤病毒亚型。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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