本发明属于生物技术领域，具体是一种生产高光学纯(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建，及其在利用木薯粉和棉籽蛋白粉等非粮原料生产高光学纯(r,r)-2,3-丁二醇中的应用。
背景技术：
2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一种平台化合物，在化工、食品、能源、医药等领域具有广泛的应用价值，其微生物发酵生产是现代生物化工的重要课题。2,3-丁二醇分子中含有两个手性碳原子，因此存在三种光学异构体，分别是(2r,3r)-2,3-丁二醇、(2s,3s)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。单一构型的(r,r)-2,3-丁二醇除了具有混合构型2,3-丁二醇的功能外，还是合成手性试剂和手性配体的重要前体，在高价值手性液晶材料、农药和医药中间体非对称合成方面具有特殊应用。传统化学合成法获得的2,3-丁二醇是三种光学异构体的混合物，不但存在过程繁琐、产率低、环境污染严重等问题，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质相近，手性拆分成本十分高昂，难以实现大规模低成本生产。因此，开展微生物高效合成单一构型(2r,3r)-2,3-丁二醇的研究具有重要的意义。
与传统化学合成法相比，2,3-丁二醇的微生物发酵法对环境友好，工艺简单，符合绿色化工的要求。目前2,3-丁二醇的高产菌种大多属于致病微生物，如klebsiellapneumoniae、klebsiellaoxytoca、enterobacteraerogenes、serratiamarcescens、enterobactercloaca，因此限制了这些菌株的产业化应用。另外，目前已报道的2,3-丁二醇发酵菌株所产的2,3-丁二醇多为两种或三种光学异构体的混合物【biotechnoladv,2011,29:351-364】，同样存在手性拆分、成本高昂的问题。paenibacilluspolymyxa是非致病菌(riskgroup1,nonpathogenicmicroorganism)，而且其能够高效生产光学纯度大于98％的(r,r)-2,3-丁二醇，因此是研究制备(r,r)-2,3-丁二醇的常用微生物。p.polymyxa的碳源范围非常广泛，但是关于其高产(r,r)-2,3-丁二醇(>50g/l)的报道均需使用高价的蔗糖或葡萄糖作为碳源。如
近年来，利用代谢工程和合成生物学方法改造b.licheniformis、s.cerevisiae和e.coli等合成(r,r)-2,3-丁二醇的研究，成为了新兴的研究思路。qi等敲除b.licheniformiswx-02的meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因，从而阻断了meso-2,3-丁二醇的合成途径，使用葡萄糖作为碳源，缺失突变株能够积累30.8g/l的(r,r)-2,3-丁二醇【biotechnologyforbiofuels,2014,7:16】。kim等在s.cerevisiae中表达来自b.subtilis的α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶，同时过量表达内源的2,3-丁二醇脱氢酶，通过葡萄糖补料发酵能够产生43.6g/l的2,3-丁二醇立体异构体混合物，其中(r,r)-2,3-丁二醇所占比例为97％【journalofbiotechnology,2014,192:376-382】。ji等将来自于k.pneumoniaecicc10011的budb、buda基因和来自于b.subtilis168的(r,r)-2,3-bdh编码基因ydjl克隆到e.colimg1655中，构建得到单一生产(r,r)-2,3-丁二醇的工程菌，经一系列发酵条件优化，最终工程菌在葡萄糖补料发酵阶段(r,r)-2,3-丁二醇的最高产量达到115g/l，光学纯度大于99％【biotechnologyandbioengineering,2015,112:1056-1059】。通过代谢工程和合成生物学方法改造可以显著提高菌株合成(r,r)-2,3-丁二醇的能力，但仍未解决碳源、氮源成本过高的问题。而目前使用廉价碳源发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇的方法，则由于菌株的生产能力不足导致(r,r)-2,3-丁二醇产量偏低，或者光学纯度达不到要求。如中国专利201610402441.3公开了一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的应用，该菌株为芽孢杆菌bacillussp.h15-1cgmccno.12389，利用本发明菌株，以脱胚玉米粉水解液为主要原料，采用机械搅拌通风发酵罐在50℃发酵68h可以产生32.1g/l的2,3-丁二醇。中国201410748634.5专利公开了利用一株环境安全菌株bacillusamyloliquefacienscctccm2012349，以酒糟为唯一碳氮源，发酵生产2,3-丁二醇的方法，该方法将种子液按4％接种量接种于发酵培养基中，在37℃，空气流量为120m3/h·m3培养基，搅拌转速为350r/min条件下进行发酵培养，发酵60h，发酵液含有50.6g/l的2,3-丁二醇。中国专利201210134936.4公开了利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的方法，提供了以使用玉米芯提取木糖后的残渣为原料进行同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的方法：以玉米芯残渣为碳源，尿素为氮源，利用肺炎克雷伯氏菌cicc10011、产酸克雷伯氏菌cicc21518、多粘类芽孢杆菌cicc10010、阴沟肠杆菌cicc10014及其混合菌液进行同步糖化发酵，2,3-丁二醇最高产量为35g/l。
单纯的基因工程方法制备工程菌株或采用廉价原料发酵(r,r)-2,3-丁二醇，都或多或少存在着难以解决的弊端，因此将基因工程方法与廉价碳源结合，一方面提高菌株生产(r,r)-2,3-丁二醇的能力，另一方面尽可能降低原料成本，是未来工业化生产(r,r)-2,3-丁二醇的方向。
技术实现要素：
本发明针对现有合成(r,r)-2,3-丁二醇技术存在的问题，提供一种生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法及其应用。本发明通过构建多顺反子表达载体，再导入宿主菌e.coli，获得生产(r,r)-2,3-丁二醇的基因工程菌株，同时还使用代谢工程技术对代谢网络进行优化，敲除主要副产物合成途径的关键基因，提高(r,r)-2,3-丁二醇的产量、光学纯度与转化率。本发明还提供利用非粮木薯粉和廉价氮源作为发酵原料生产(r,r)-2,3-丁二醇的工艺，代替高纯糖和高价氮源，可大幅降低原料成本。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化，在基因的核苷酸序列前面添加含核糖体结合位点和间隔序列的核苷酸序列；(2)将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇；(3)将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；(4)将多顺反子重组质粒导入宿主菌e.coli，获得生产(r,r)-2,3-丁二醇的基因工程菌株；所述宿主菌e.coli为多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得。
进一步地，所述核糖体结合位点和间隔序列的核苷酸序列为taaggaggatataca。
在细胞内，核糖体负责将mrna翻译成蛋白质，16srrna是核糖体的一个亚基，它可与核糖体结合位点通过碱基互补原则精确识别，在基因前面添加taaggaggatatac序列，可以增强核糖体与mrna的识别与结合能力，而适当的间隔序列也可以提高翻译效率，在相同的转录水平下，提高了α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和丁二醇脱氢酶的活力，酶促反应加快，最终提高(r,r)-2,3-丁二醇的合成能力。
进一步地，所述宿主菌e.coli为多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括meso-2,3-丁二醇、丁二酸、甲酸、乙醇和乙酸；所述合成副产物的关键基因包括dar、frdabcd、pflb、adhe和pta。
进一步地，所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株选自enterobactercloacae、klebsiellapneumoniae、serratiamarcescens、paenibacilluspolymyxa、enterobacteraerogenes、klebsiellaoxytoca和bacilluslicheniformis。
所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株优选enterobactercloacae、klebsiellapneumoniae、serratiamarcescens。
进一步地，所述的(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株选自paenibacilluspolymyxa、bacillussubtilis、bacilluspumilus、saccharomycescerevisiae、bacilluslicheniformis。
本发明还提供所述基因工程菌株在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100℃下液化0.5-5h，静置冷却；当温度降低至55℃以下时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20h，调节ph6.5-7.5，离心或过滤收集上清，稀释上清液后在115℃条件下灭菌15min，即得；按1000ml水计，所述液化和糖化的各组分用量为：木薯粉100-200g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2ml，氯化钙0.01-0.5g，糖化酶0.2-1ml，蛋白酶0.05～0.5g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得，所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或一种以上组合；
(2)在无菌条件下，在发酵培养基中添加50-100μg/ml氨苄青霉素，然后移至发酵罐中，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为1-10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度35-42℃、搅拌转速200-800rpm、通气量0.2-1.0vvm条件下发酵培养20-72h，当检测发酵液中(r,r)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束。
所述氮源原料优选棉籽蛋白粉、豆粕粉；所述发酵培养温度优选37-40℃，搅拌转速优选400-500rpm，通气量优选0.3-0.5vvm。
在液化和糖化过程中，使用液化酶和糖化酶单独水解木薯粉，浓缩后可得到木薯还原糖母液。
进一步地，所述基因工程菌菌液的制备方法，包括以下步骤：(1)将生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株划线到含有质量体积比为1.8％琼脂和含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，在37℃培养10-15h；在无菌的条件下，挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体种子培养基中，37℃摇床震荡培养10-15h；所述lb培养基的配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
进一步地，在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，当葡萄糖浓度降至10-30g/l时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/l；所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800g/l。
与现有技术相比，本发明的有益及有益效果为：
1、本发明提供的生产(r,r)-2,3-丁二醇工程菌株能有效利用来源广泛、成本低廉的原料，菌株无致病性，菌株的(r,r)-2,3-丁二醇产量、光学纯度和生产效率高，最高产量可达到93.5g/l，光学纯度可达99％以上，克服了现有技术存在的问题。
2、本发明菌株的构建方法具有操作简便、效率高、成本低廉等优点，容易实现工业化生产。
3、本发明利用代谢工程敲除宿主菌合成副产物的关键基因，提高了(r,r)-2,3-丁二醇产量的产量和收率，同时副产物浓度的降低有利于(r,r)-2,3-丁二醇的下游提取，能够降低下游成本。
4、基于ptrc99a载体的基因表达无需添加具有毒性并且成本较高的诱导剂iptg，工程菌株的外源基因表达水平即可满足高效合成(r,r)-2,3-丁二醇的需要，同时由于不需要表达转录调控因子，因此培养基中无需添加具有细胞毒性的乙酸(盐)解除转录抑制，降低了生产成本，同时避免基因过量表达产生的代谢负荷，工程菌株性质稳定。
5、本发明利用非粮木薯粉为碳源，棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源，替代已有报道使用的高纯糖、酵母粉用于发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇，不仅可以提高这些廉价原料的综合利用价值，还为(r,r)-2,3-丁二醇发酵提供了更加廉价的原料，可大幅降低(r,r)-2,3-丁二醇发酵的原料成本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。
下述实施例中所涉及的材料：(1)液化酶、糖化酶、蛋白酶为商业化产品，可购于诺维信(中国)生物技术有限公司等公司；(2)棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉为商业化产品，可购于青岛科瑞培养基有限公司等公司。
下述实施例在发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇过程中，采用sba-40c分析仪检测发酵液中葡萄糖浓度，利用液相色谱测定主要副产物的浓度，利用气相色谱测定2,3-丁二醇各种立体异构体的浓度并计算光学纯度。
实施例1
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr1的构建：
对paenibacilluspolymyxadsm365的基因组序列进行分析，获得该菌株的(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh，同时与来源于enterobactercloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budb、α-乙酰乳酸脱羧酶基因buda的核苷酸序列进行密码子优化，在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列taaggaggatataca，然后利用人工合成的方法获得基因簇budb-buda-bdh，其核苷酸序列长度为3574个碱基，核苷酸序列如seqidno.1所述。利用双酶切与连接的方法，将基因簇budb-buda-bdh插入质粒ptrc99a的启动子后面，获得多顺反子重组质粒ptrc99a-budb-buda-bdh，再将重组质粒ptrc99a-budb-buda-bdh导入宿主菌e.colimg1655，获得产(r,r)-2,3-丁二醇的基因工程菌株gxasr1。
实施例2
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr2的构建：
对paenibacilluspolymyxadsm365的基因组序列进行分析，获得该菌株的α-乙酰乳酸合成酶基因alss、α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsd的核苷酸序列。对alss、alsd和来源于paenibacilluspolymyxa的(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh的核苷酸序列进行密码子优化，在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列taaggaggatataca，然后利用人工合成的方法获得基因簇alss-alsd-bdh，其核苷酸序列长度为3562个碱基，核苷酸序列如seqidno.2所述。再将基因簇alss-alsd-bdh插入质粒ptrc99a的启动子后面，获得多顺反子重组质粒ptrc99a-alss-alsd-bdh，将其导入宿主菌e.colimg1655，获得产(r,r)-2,3-丁二醇的基因工程菌株gxasr2。
实施例3
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr3的构建：
通过分析发现工程菌株gxasr1和gxasr2发酵的主要副产物为meso-2,3-丁二醇、丁二酸、甲酸、乙醇和乙酸，其合成途径的关键基因是dar、frdabcd、pflb、adhe和pta。利用大肠杆菌λ噬菌体来源的red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理，先用两侧带有frt位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达flp重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的，具体步骤如下：
将pkd46质粒转化入宿主细胞，制备电转化感受态细胞；利用引物进行pcr构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化入含pkd46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pcp20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株e.colimg1655/δdarδfrdabcdδpflbδadheδpta，制备电转化感受态细胞，实施例1构建的多顺反子重组质粒ptrc99a-budb-buda-bdh电转导入多基因缺失突变株，获得工程菌株gxasr3。
所述的引物序列分别为：
dar-f:tcatgccgaccaaaatattacccaatgaaatatccacgcacctcactgcgcatatgaatatcctccttagttcctattc。
dar-r:atatgcgccttctatacttaacgtttattcagcgttaagtggagaactcggagctgcttcgaagttccta。
frdabcd-f:cttaccctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtccatatgaatatcctccttagttcctattc。
frdabcd-r:cgccataggcgggccggatttacattggcgatgcgttagattgtaacgacgagctgcttcgaagttccta。
adhe-f:attcgagcagatgatttactaaaaaagtttaacattatcaggagagcattcatatgaatatcctccttagttcctattc
adhe-r:tcggcattgcccagaaggggccgtttatgttgccagacagcgctactgagagctgcttcgaagttccta
pflb-f:gtggagcctttattgtacgctttttactgtacgatttcagtcaaatctaacatatgaatatcctccttagttcctattc
pflb-r:aaataaaaaatccacttaagaaggtaggtgttacatgtccgagcttaatgagctgcttcgaagttccta
pta-f:gtaacgaaagaggataaaccgtgtcccgtattattatgctgatccctacccatatgaatatcctccttagttcctattc
pta-r:ttatttccggttcagatatccgcagcgcaaagctgcggatgatgacgagagagctgcttcgaagttccta
实施例4
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr4的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为enterobacteraerogenes，(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为bacillussubtilis。
实施例5
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr5的构建：
本实施例与实施例3的不同之处是：将实施例4构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株，获得工程菌株gxasr5。
实施例6
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr6的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为serratiamarcescens，(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为bacilluspumilus。
实施例7
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr7的构建：
本实施例与实施例3的不同之处是：将实施例6构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株，获得工程菌株gxasr7。
实施例8
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr8的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为enterobacteraerogenes，(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为saccharomycescerevisiae，宿主菌为e.colibw25113。
实施例9
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr9的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为klebsiellaoxytoca，(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为bacilluslicheniformis。
实施例10
生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasr10的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为bacilluslicheniformis，(r,r)-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为bacilluspumilus。
实施例3-10合成基因簇的方法与实施例1或2相同，或为现有常规技术方法，本领域技术人员能够通过本申请公开的内容获悉该基因簇的核苷酸序列，对此不再累述实施例3-10对应合成的基因簇的核苷酸序列。
应用实施例1
工程菌株gxasr1、gxasr2、gxasr3、gxasr4、gxasr5、gxasr6、gxasr7、gxasr8、gxasr9、gxasr10在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉180g十份，分别加入烧杯中，每份再各补加入60g棉籽蛋白粉、1000ml自来水、0.5ml液化酶和0.2g氯化钙，充分摇匀后，95℃液化1.5h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.5ml糖化酶和0.1g蛋白酶，在55℃糖化20h，调节ph7.5，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素，分别取500ml转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取活化好的gxasr1、gxasr2、gxasr3、gxasr4、gxasr5、gxasr6、gxasr7、gxasr8、gxasr9、gxasr10工程菌菌液以体积比为5％的接种量分别接种到上述发酵培养基中，其中gxasr9、gxasr10添加0.01mm的iptg，然后在温度37℃、搅拌转速400rpm、通气量0.5vvm条件下发酵培养，发酵16h、28h分别补糖50g/l，至(r,r)-2,3-丁二醇浓度不再增加时结束发酵，取样并利用气相色谱和液相色谱测定产物(r,r)-2,3-丁二醇及副产物meso-2,3-丁二醇、丁二酸、甲酸、乙醇和乙酸的浓度，并计算(r,r)-2,3-丁二醇的光学纯度，测定结果如表1所示。
所述工程菌菌液的活化方法：将生产(r,r)-2,3-丁二醇的gxasr1、gxasr2、gxasr3、gxasr4、gxasr5、gxasr6、gxasr7、gxasr8、gxasr9、gxasr10工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养12h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养10h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
表1不同工程菌株的发酵产物
从表中可以得知，敲除副产物合成途径的关键基因dar、frdabcd、pflb、adhe和pta，工程菌株gxasr3、gxasr5、gxasr7的(r,r)-2,3-丁二醇产量和光学纯度，与未经过敲除处理的工程菌株(分别对应于gxasr1、gxasr4、gxasr6)相比显著提高，同时主要副产物的的浓度大大降低，因此敲除副产物合成途径的关键基因不但提高了(r,r)-2,3-丁二醇产量和光学纯度，而且有利于下游的产物提取，能够降低生产成本并提高产品的质量(光学纯度高)。
应用实施例2
工程菌株gxasr3在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉160g四份，分别加入烧杯中，再分别加入55g豆粕粉、65g豆饼粉、60g花生蛋白粉、66g棉籽蛋白粉，再加入1000ml自来水、1.5ml液化酶和0.6g氯化钙，充分摇匀后，90℃液化2h，静置冷却；温度降低至50℃以下时，加入0.5ml糖化酶和0.3g蛋白酶，在55℃糖化24h，调节ph6.5，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中100μg/ml氨苄青霉素，分别取500ml添加至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的gxasr3工程菌菌液以体积比为10％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度40℃、搅拌转速300rpm、通气量0.3vvm条件下发酵培养，发酵12h和24h分别补糖50g/l，发酵液中(r,r)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时发酵结束。经过测定豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉、棉籽蛋白粉对应的(r,r)-2,3-丁二醇产量分别是81.5g/l、71.6g/l、70.3g/l、93.5g/l，光学纯度分别为99.2％、99.3％、99.2％、99.4％。
所述gxasr3工程菌菌液的活化方法：将gxasr3工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养15h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
应用实施例3
工程菌株gxasr5在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为150目的木薯粉；称取木薯粉175g，加入烧杯中，再加入68g棉籽蛋白粉，再加入1000ml自来水、1.0ml液化酶和0.4g氯化钙，充分摇匀后，95℃液化2h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.8ml糖化酶和0.3g蛋白酶，在55℃糖化18h，调节ph7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素，取500ml转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的gxasr5工程菌菌液以体积比为8％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速500rpm、通气量0.8vvm条件下发酵培养12h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为28.5g/l，补糖50g/l，发酵24h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵48h后，(r,r)-2,3-丁二醇产量为75.6g/l，光学纯度达到99.3％。
所述gxasr5工程菌菌液的活化方法：将gxasr5工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养10h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
应用实施例4
工程菌株gxasr6在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为60目的木薯粉；称取木薯粉115g，加入烧杯中，再加入45g豆粕粉，再加入1000ml自来水、1.5ml液化酶和0.1g氯化钙，充分摇匀后，85℃液化5h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.4ml糖化酶和0.2g蛋白酶，在60℃糖化6h，调节ph7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中添加60μg/ml氨苄青霉素，取500ml转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的gxasr6工程菌菌液以体积比为2％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度42℃、搅拌转速500rpm、通气量1.0vvm条件下发酵培养15h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为30.6g/l，补糖50g/l，发酵36h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵48h后，(r,r)-2,3-丁二醇产量为78.3g/l，光学纯度达到99.0％。
所述gxasr6工程菌菌液的活化方法：将gxasr6工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养12h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
应用实施例5
工程菌株gxasr7在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为200目的木薯粉；称取木薯粉160g，加入烧杯中，再加入18g豆粕粉、18g棉籽蛋白粉和22g花生蛋白粉，再加入1000ml自来水、1.0ml液化酶和0.3g氯化钙，充分摇匀后，100℃液化1h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.8ml糖化酶和0.15g蛋白酶，在50℃糖化20h，调节ph7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中添加80μg/ml氨苄青霉素，取500ml转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的gxasr7工程菌菌液以体积比为5％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速450rpm、通气量0.2vvm条件下发酵培养14h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为20.1g/l，补糖30g/l，发酵24h、48h、64h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵72h后，(r,r)-2,3-丁二醇产量为79.1g/l，光学纯度达到99.2％。
所述gxasr7工程菌菌液的活化方法：将gxasr7工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养10h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
应用实施例6
工程菌株gxasr8在生产(r,r)-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉150g，加入烧杯中，再加入40g棉籽蛋白粉和25g花生蛋白粉，再加入1000ml自来水、1.1ml液化酶和0.4g氯化钙，充分摇匀后，90℃液化3h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.8ml糖化酶和0.4g蛋白酶，在55℃糖化12h，调节ph7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/l，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)在发酵培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素，取500ml转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的gxasr8工程菌菌液以体积比为8％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度38℃、搅拌转速350rpm、通气量0.8vvm条件下发酵培养16h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为18.5g/l，补糖40g/l，发酵2432h、40h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵60h后，(r,r)-2,3-丁二醇产量为80.0g/l，光学纯度达到99.4％。
所述gxasr8工程菌菌液的活化方法：将gxasr8工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养15h；在无菌的条件下，用牙签挑取lb平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养10h；所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠。
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<110>南宁邦尔克生物技术有限责任公司，广西科学院
<120>生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法及其应用
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