一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种3d培养自体脂肪mscs来源的神经前体细胞的方法。

背景技术：

神经干细胞和神经祖细胞是神经元、神经胶质细胞等神经细胞的前体细胞，目前还没有准确区分二者的方法。神经前体细胞（neuralprecursorcells，npcs）在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与npcs缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体npcs能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但存在免疫排斥反应，嵌合率低，自体npcs移植的医疗前景更令人期待。成体npcs的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离npcs又受到伦理学限制，样本资源成为限制npcs研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。mscs是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞（mesenchymalstemcells，mscs）能分化成netstin+神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。骨髓样本采集对供者负担大、顾虑多，但临床抽脂技术非常成熟，相比于脐带等围产期组织和自体骨髓，自体脂肪mscs衍生npcs移植治疗神经损伤具有更多的样本来源优势。目前的研究发现，使用egf、bfgf等细胞因子可以诱导mscs向神经组织细胞分化。但如果要得到均一性高的nestin+npcs则需要经过神经球培养阶段。神经球培养是将mscs接种至疏水培养容器中培养，形成多细胞聚集的细胞球，属于半悬浮培养体系，其培养容量小、操作复杂、难于传代扩增，导致细胞收率低，限制了基于npcs的神经组织修复医学的产业化转化。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现要素：

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种3d培养自体脂肪mscs来源的神经前体细胞的方法，能够批量培养高纯度的自体脂肪mscs来源npcs。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种3d培养自体脂肪mscs来源的神经前体细胞的方法，包括如下步骤：

s1.制备胶原3d支架；

s2.采集脂肪组织，分离脂肪细胞，以mscs培养基培养收获p0代mscs，p0代mscs以mscs培养基重悬，培养收获p1代mscs；

s3.预处理胶原3d支架；

s4.以mscs培养基重悬p1代mscs，接种至含胶原3d支架的组织培养皿中，使用npcs培养基继续培养6天，收获npcs。

进一步地，所述制备胶原3d支架的方法为：将胶原海绵修剪成片，将若干个胶原海绵片垛叠在一起为一个培养单位，以含重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白的dmem/f12浸泡，孵育过夜，以生理盐水浸泡漂洗，淋干后置于无菌密封容器中，于4℃保存不超过30天，备用。

进一步地，所述步骤s2中分离脂肪细胞的方法为：剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状；用生理盐水重悬离心后取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，37℃水浴30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物，筛网过滤，滤液离心弃上清，以pbs重悬，静置，吸弃悬浮物后离心弃上清。

进一步地，所述步骤s2中培养收获p0代mscs的方法为：以mscs培养基重悬脂肪细胞，调整细胞密度为5×10⁵/ml，接种至组织培养瓶中，于co2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；400g离心5min，弃上清，收获沉淀物；生理盐水洗涤后，以细胞筛过滤，滤液400g离心5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代mscs。

进一步地，所述步骤s2中培养收获p1代mscs的方法为：p0代mscs以mscs培养基重悬，调整细胞密度为6000个/cm²，接种至组织培养瓶，于co2培养箱内培养至70-80%汇合时收获p1代mscs。

进一步地，所述步骤3中预处理胶原3d支架的方法为：将5片直径8cm的胶原3d支架垛叠在一起，置于组织培养皿中，加入mscs培养基，置于于37℃，5%co2培养箱内培养过夜，取出胶原3d支架，淋干培养基，转移至新的组织培养皿中备用。

进一步地，培养收获npcs的方法为：以mscs培养基重悬p1代mscs，调整细胞密度至2×10⁶/ml，吸取30ml细胞悬液，接种至含胶原3d支架的15cm组织培养皿中，置于于37℃，5%co2培养箱内培养4天，取出胶原3d支架，淋干培养基，转移至新的15cm组织培养皿中，补充30mlnpcs培养基培养6天，收获；收获时吸弃npcs培养基，生理盐水浸泡5分钟，更换若干次生理盐水至无色，加入消化液室温消化10分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；吸取消化液，以生理盐水洗涤胶原3d支架，合并消化液和洗液，以细胞筛过滤，滤液400g离心5min，弃上清，收获沉淀物，即为npcs。

进一步地，所述npcs培养基为含有如下物质的dmem/f12：

1×b27，

10%无动物源成分血清替代品，

0.1nm人二氢睾丸酮，

40ng/ml全反式维甲酸，

50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

25ng/ml重组人表皮生长因子，

2mml-谷氨酰胺。

进一步地，所述步骤s2中，所述脂肪组织来源于腹部脂肪。

进一步地，采集脂肪组织前对脂肪提供者体检，提供者应无肿瘤史、无病毒感染、无支原体感染，采集后立即置于含保存液的冰浴无菌瓶中，所述保存液为含有50ug/ml硫酸庆大霉素的dmem/f12。

本发明的有益效果：通过采用层黏连蛋白和玻连蛋白包被胶原海绵构建胶原3d支架，能促进mscs粘附，抑制其神经元分化。然后以mscs培养基预处理胶原3d支架，防止mscs粘附过程中成团，最大程度保证单细胞粘附。采集腹部脂肪分离、扩增mscs，采用胶原3d支架培养npcs，能获得的npcs，能够满足自体脂肪mscs来源npcs的纯度和制备需求。

附图说明

图1是p0代脂肪mscs培养第3天的细胞形态图；

图2是p0代脂肪mscs培养第9天的细胞形态图；

图3是p1代脂肪mscs培养第1天的细胞形态图；

图4是p1代脂肪mscs培养第4天的细胞形态图；

图5是胶原3d支架复合脂肪mscs培养第2天的细胞形态图；

图6是胶原3d支架复合脂肪mscs培养第4天的细胞形态图；

图7是胶原3d支架复合脂肪mscs来源的npcs培养第2天的细胞形态图；

图8是胶原3d支架复合脂肪mscs来源的npcs培养第6天的细胞形态图；

图9是npcs培养至第6天免疫荧光检测nestin表达图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从商业途径获得。

首先，对本发明具体实施例中涉及的试剂进行简单的说明。

重组人层黏连蛋白：货号ln111-ln521，生产厂家biolamina。

重组人玻连蛋白：货号af-140-09，生产厂家peprotech。

dmem/f12：一种细胞培养基，货号12400-024，生产厂家gibco。

硫酸庆大霉素：货号e003632，生产厂家sigma。

collagenasenb1：一种胶原蛋白水解酶，货号17455.03，生产厂家serva。

rhdnase-i：重组人脱氧核糖核酸酶，货号enz-319，生产厂家prospec。

ultraculture：无血清培养基，货号12-725f，生产厂家lonza。

ultrosergserumsubstitute：血清替代物，货号15950-017，生产厂家pall。

胰蛋白酶溶液：货号t6424-1vl，生产厂家biologicalindustries。

抑肽酶溶液：货号a1250000，生产厂家sigma。

b27：无血清添加剂，货号17504，生产厂家gibco。

10%无动物源成分血清替代品：货号c08003c，生产厂家stemboscience

人二氢睾丸酮：货号a8380，生产厂家sigma。

全反式维甲酸：货号r2625，生产厂家sigma。

重组人碱性成纤维细胞生长因子：货号af100-18b，生产厂peprotech

重组人表皮生长因子：货号af100-15，生产厂家peprotech。

l-谷氨酰胺：货号25030-081，生产厂家gibco。

accutasetm消化液：货号40506es60，生产厂家innovativecelltechnologies,inc。

实施例一：胶原3d支架制备

胶原海绵（货号：1050030，生产厂家：艾微停）修剪成直径8cm，厚度0.3cm的圆形片，每5片垛叠在一起为一个培养单位，以含10ng/重组人层黏连蛋白，100ng/ml重组人玻连蛋白的dmem/f12浸泡，于37℃孵育过夜；以生理盐水浸泡、漂洗3次，淋干，置于无菌密封容器中，4℃保存不超过30天，备用。

实施例二：p1代脂肪mscs培养

2.1脂肪采集

采集前供者体检，应无肿瘤史、无病毒感染、无支原体感染。脂肪采集在专业医疗采集机构采集。腹部皮下抽脂50ml。采集后立即置于125ml冰浴无菌瓶（货号2019-0250，生产厂家nalgene）中，无菌瓶中含20ml保存液，保存液为含有50ug/ml硫酸庆大霉素的dmem/f12。

2.2脂肪细胞分离

剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的含50ug/ml硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，收集脂肪层和沉淀层，以二倍体积的消化液消化，该消化液中含有0.15mg/mlcollagenasenb1和50iu/mlrhdnase-i，37℃水浴，30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以pbs重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清。

2.3p1代脂肪mscs培养

以mscs培养基（含2%ultrosergserumsubstitute的ultraculture）重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁵/ml，接种至175cm²组织培养瓶（货号easyflask，生产厂家nunc）中，于37℃，5%co2培养箱内培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1ml抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代mscs；p0代mscs以mscs培养基重悬，调整细胞密度为6000/cm²，接种至175cm²组织培养瓶，培养至70-80%汇合时收获p1代mscs。

实施例三：胶原3d支架预处理

将5片直径8cm的胶原3d支架垛叠在一起，置于15cm组织培养皿（货号168381，生产厂家nunc）中，加入30mlmscs培养基，置于于37℃，5%co2培养箱内培养过夜；取出胶原3d支架，淋干培养基，转移至新的15cm组织培养皿中，备用。

实施例四：胶原3d支架培养脂肪mscs来源的npcs

以mscs培养基重悬p1代mscs，调整细胞密度至2×10⁶/ml，吸取30ml细胞悬液，接种至含胶原3d支架的15cm组织培养皿中，置于于37℃，5%co2培养箱内培养4天，取出胶原3d支架，淋干培养基，转移至新的15cm组织培养皿中，小心补充30mlnpcs培养基，培养6天，收获；收获时吸弃npcs培养基，生理盐水浸泡5分钟，换3次生理盐水至无色，加入30mlaccutasetm消化液室温消化10分钟，加入5ml抑肽酶溶液终止消化；吸取消化液，以生理盐水洗涤胶原3d支架3次，合并消化液和洗液，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液，400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物，即为npcs。

npcs培养基是包括以下物质的dmem/f12：

1×b27，

10%无动物源成分血清替代品，

0.1nm人二氢睾丸酮，

40ng/ml全反式维甲酸，

50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

25ng/ml重组人表皮生长因子，

2mml-谷氨酰胺。

实施例五：组织学检测

npcs活细胞检测：取出npcs细胞-胶原3d支架，淋干培养基，生理盐水浸泡5分钟，换3次生理盐水至无色，以live/dead试剂盒（货号l3224，生产厂家invitrogen）行活细胞染色，515nm检测绿色荧光为活细胞；

npcs细胞染色：1×10⁶/ml的npcs悬液甩片，以4％多聚甲醛固定细胞10分钟，以pbs漂洗2次，滴加一抗，4℃过夜；pbs漂洗2次，滴加fitc标记二抗，室温孵育1小时，pbs漂洗2次，镜检。

免疫组织学检测使用抗体包括：

一抗：mouseanti-nestin（1:400，生产厂家millipore）；

fitc标记二抗：猴抗鼠igg(1:200，生产厂家lifetechnologies）。

实施例六：统计学分析

统计学分析采用spss17.0进行统计学处理。数据以±s表示，均值比较采用独立样本t-test，p<0.05有统计学意义。

统计结果如下：

6.1p1代脂肪mscs培养形态图，如图1~4所示。

50ml脂肪组织分离得到平均6.85±1.07×10⁷细胞，约按5×10⁵/ml接种培养，第3天时有少量克隆出现，第9天时70-80%汇合，收获细胞2.44±0.70×10⁷p0代脂肪mscs。p0代细胞约按6000个/cm²接种培养，第4天时收获1.52±0.42×10⁸p1代脂肪mscs。

6.2胶原3d支架培养脂肪mscs来源的npcs

按2×10⁶/ml接种p1代mscs，胶原3d支架平均吸附细胞量为1.13±0.38×10⁷。培养第4天换npcs培养基前，mscs在胶原3d支架中平行生长（培养第2天和培养第4天分别如图5~图6所示）。

附着mscs平均为7.05±1.61×10⁷。换npcs培养基培养第2天，细胞形态发生极性改变，逐步形成细胞团，周围有细胞爬出（培养第2天和培养第6天分别如图7~图8所示）。

收获npcs平均为2.52±0.82×10⁸。npcs培养至第6天，收获细胞，甩片，免疫荧光检测，其中93.25±8.85%表达nestin（如图9所示）。

本发明采用层黏连蛋白和玻连蛋白包被胶原海绵构建胶原3d支架，能促进mscs粘附，抑制其神经元分化。然后以mscs培养基预处理胶原3d支架，防止mscs粘附过程中成团，最大程度保证单细胞粘附。结果发现随着培养时间的延长，p1代脂肪mscs在胶原3d支架内多层生长，平行排列，培养4天，每个培养单位mscs扩增了6.24倍，培养效率较单层培养极大提高。更换npcs培养基后，细胞形态逐渐改变，呈现双极性、三极性形态，并逐渐有类似神经球的细胞团出现，但细胞团包含细胞较少，至培养第6天，胶原3d支架内细胞密度极大，较培养第4天的mscs，每个培养单位npcs数量扩增了约3.58倍，此时，nestin+细胞比例约为93.25±8.85%。如果继续培养，细胞团会很致密，难于消化分离npcs，而且细胞死亡、凋亡严重，大概因培养基营养供应和气体交换缺乏所致，需要进一步优化培养结构，增加流量换液和换气能力。但从本发明目前得到的结果显示，采集50ml腹部脂肪分离、扩增mscs，采用胶原3d支架培养npcs，应能获得3.40×10⁹，93.25%nestin+npcs，能够满足自体脂肪mscs来源npcs的纯度和制备需求。