一种人肿瘤相关的甲基化位点及其筛选方法和用途与流程

本发明属于子宫内膜癌诊断以及检测技术领域，具体涉及一种人肿瘤相关的甲基化位点及其筛选方法和用途。

背景技术：

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，每年有接近20万的新发病例，是导致死亡的第三位常见妇科恶性肿瘤。由于致病因素复杂、发病机制不明，对子宫内膜癌的早期诊断和检测非常困难，往往发现患有子宫内膜癌时已经是中晚期，导致患者错失治疗子宫内膜癌的最佳良机。

近年来有研究表明，dna甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。所谓dna甲基化是一种表观遗传修饰，它是由dna甲基转移酶(dnamethyl-transferase，dnmt)催化s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mc)的一种反应，在真核生物dna中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。cg二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mc约占c总量的2-7％。一般说来，dna的甲基化会抑制基因的表达。在正常组织内，基因的甲基化主要分布在缺少cpg位点的编码区。

肿瘤的特征是不平衡的甲基化。在肿瘤中，伴随基因组的低甲基化是区域性的高甲基化，及dna甲基化转移酶的基因表现上升。有证据显示基因组的低甲基化可以导致染色体的不稳定及增加突变机会，在细胞中的整体甲基化状态可能是引发癌症的促进因素。某些基因的甲基化状态会是肿瘤生成的生物标志，比如说，谷胱甘肽s转移酶pi基因的甲基化已被建议作为前列腺癌的诊断指标。环境因素(厨房油烟，汽车尾气等)会改变表观遗传形状(cpg甲基化或去甲基化)，造成基因不正常的表达或沉默，普遍认为，这种变化可能与癌症的起因有直接的关系。如肥胖因素已被确认为肿瘤疾病的风险因素，而身体质量指数(bmi)是广泛应用于评估肥胖的指标。高水平bmi指bmi数值大于25kg/m²，包括过重和肥胖，对多种类型的肿瘤的发病和死亡都发挥着重要的作用。当前，高水平bmi的发病率逐年上升，随之，肿瘤的发病率也大量上升。人们使用全基因组表观遗传分析方法研究高水平bmi诱导的dna甲基化的改变在疾病中的作用，大量的研究结果已经表明：在血液和肥胖组织中，代谢相关的基因的dna甲基化水平因肥胖因素而改变。由于dna甲基化的改变参与肿瘤的发生和发展，可通过检测由bmi引起的dna甲基化的改变来对肿瘤进行早期的诊断和预防，然而基于bmi引起的dna甲基化的改变在子宫内膜癌的发生和发展中所发挥的潜在作用还尚未被研究。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种人子宫内膜癌相关的甲基化位点及其筛选方法和用途。

为此，本发明提供了人肿瘤相关的甲基化位点，所述的甲基化位点选自人第18号染色体、人第3号染色体和人第2号染色体上的至少一个甲基化位点。

所述的人肿瘤相关的甲基化位点，所述的甲基化位点所在的核苷酸序列选自如seqidno.1所示的核苷酸序列、seqidno.2所示的核苷酸序列和seqidno.3所示的核苷酸序列。

所述的人肿瘤相关的甲基化位点，所述的甲基化位点选自cg12645852、cg09621472和cg14044785中的至少一个。其中，cg12645852位于第18号染色体的74198774；所述甲基化位点cg09621472位于第3号染色体的113439314，位于naa50基因上；所述甲基化位点cg14044785位于第2号染色体的43560368，位于thada基因上。

所述的人肿瘤相关的甲基化位点为人子宫内膜癌相关的甲基化位点。

本发明提供了人肿瘤相关的甲基化位点的筛选方法，包括如下步骤：

(1)获取肿瘤样本，选定身体质量指数bmi值25kg/cm²作为对所述肿瘤样本分组的的阈值，依据所述阀值将所述肿瘤样本分成对照bmi组和高水平bmi组；

(2)采用limma软件包从步骤(1)的两组中筛选出差异甲基化位点；

(3)对步骤(1)获取的肿瘤样本，采用一般线性回归模型方法对甲基化位点和bmi进行关联分析，筛选得到与bmi相关的甲基化位点；

(4)选择步骤(2)筛选的甲基化位点与步骤(3)中筛选的甲基化位点交集的甲基化位点作为候选甲基化位点，即选择步骤(2)筛选的甲基化位点与步骤(3)中筛选的甲基化位点相同的甲基化位点作为候选甲基化位点，通过秩和检验和生存分析，获得所述的人肿瘤相关的甲基化位点。

所述的人肿瘤相关的甲基化位点的筛选方法，包括如下步骤：

(1)获取子宫内膜癌样本，取bmi为25kg/m²作为所述子宫内膜癌样本分组的阈值，将bmi小于25kg/m²的子宫内膜癌样本作为对照bmi组，bmi大于或等于25kg/m²的子宫内膜癌样本作为高水平bmi组；

(2)采用limma软件包校正步骤(1)中两组的年龄、种族和肿瘤取样点三个混杂因素，通过多重假设检验，以应用错误发现率fdr小于0.05为具有统计的显著差异，筛选出显著的差异甲基化位点；

(3)通过一般线性回归模型，校正步骤(1)中所获取的子宫内膜癌样本的年龄，种族和肿瘤取样点三个混杂因素，然后使用bonferroni方法对p值进行多重校正，设定bonferroni校正后p值小于0.05的dna甲基化位点为与bmi相关的甲基化位点，筛选出与bmi相关的甲基化位点；

(4)选择步骤步骤(2)筛选的甲基化位点与步骤(3)中筛选的甲基化位点交集的甲基化位点作为候选甲基化位点，通过对两个独立的所述子宫内膜癌样本的秩和检验，比较所述候选甲基化位点在子宫内膜癌不同分级阶段，不同临床分期，不同病理子类型和肿瘤浸润程度间的甲基化水平，p值小于0.05为具有统计的显著差异，筛选出具有统计的显著差异的候选甲基化位点；然后通过kaplan-meier及log-rank统计方法进行生存分析，评估所述候选甲基化位点对子宫内膜癌的生存率的作用，p值小于0.05为具有统计的显著差异，筛选出具有统计的显著差异的候选甲基化位点；选择在秩和检验和生存分析中具有统计的显著差异的候选甲基化位点为所述的人肿瘤相关的甲基化位点。

本发明提供了一种肿瘤预后诊断标志物，包括所述的人肿瘤相关的甲基化位点或所述的人肿瘤相关的甲基化位点的筛选方法筛选得到的人肿瘤相关的甲基化位点。

本发明提供了所述的肿瘤预后诊断标志物在制备预后肿瘤发展风险的试剂中的用途。

所述的用途，所述的肿瘤为子宫内膜癌。

本发明提供了一种用于肿瘤预后诊断的引物，所述的引物是基于所述的肿瘤预后诊断标志物设计的。

本发明提供了一种用于肿瘤预后诊断的试剂盒，包括所述的用于肿瘤预后诊断的引物。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的人肿瘤相关的甲基化位点，所述甲基化位点选自人第18号染色体、人第3号染色体和人第2号染色体上的至少一个甲基化位点，由bmi引起的上述的染色体上的甲基化位点发生改变与人子宫内膜癌相关，可以通过检测上述染色体上的甲基化位点的改变进行人肿瘤的预后诊断。

2.本发明提供的人肿瘤相关的甲基化位点，所述的甲基化位点所在的核苷酸序列选自如seqidno.1所示的核苷酸序列、seqidno.2所示的核苷酸序列和seqidno.3所示的核苷酸序列，可以通过检测上述核苷酸序列上的甲基化位点改变进行人肿瘤的早期预后诊断。

3.本发明提供的人肿瘤相关的甲基化位点，所述的甲基化位点选自cg12645852、cg09621472和cg14044785，可以进一步检测上述甲基化位点的改变进行人肿瘤的早期预后诊断。

4.本发明提供的人肿瘤相关的甲基化位点的筛选方法，通过上述方法可以筛选出由bmi引起的与人肿瘤相关的甲基化位点。

5.本发明提供的肿瘤预后诊断标志物，通过所述肿瘤预后诊断标志物可以对肿瘤进行早期的预后诊断，尤其是子宫内膜癌的早期诊断。

6.本发明提供的用于肿瘤预后诊断的引物，可以通过所述引物对包括所述肿瘤预后诊断标志物的序列进行pcr扩增，焦磷酸测序检测所述肿瘤预后诊断标志物的甲基化水平，进而对肿瘤进行早期的预后诊断，尤其是子宫内膜癌的早期诊断。

7.本发明提供的用于肿瘤预后诊断的试剂盒，可以通过所述试剂盒对包括所述肿瘤预后诊断标志物的序列进行pcr扩增，焦磷酸测序检测所述肿瘤预后诊断标志物的甲基化水平，进而对肿瘤进行早期的预后诊断，尤其是子宫内膜癌的早期诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中子宫内膜癌高水平bmi组和对照bmi组两组间的甲基化位点差异情况；

图2为实施例1差异甲基化位点在基因组区域的分布情况；

图3为实施例1差异甲基化位点所在基因参与的kegg通路；

图4为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在高水平bmi组和对照bmi组两组间甲基化水平；

图5为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同分级阶段的甲基化水平；

图6为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同临床分期的甲基化水平；

图7为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同病理子类型的甲基化水平；

图8为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌肿瘤浸润程度的甲基化水平；

图9为实施例1中筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌kaplan-meier的生存分析。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种人肿瘤相关的甲基化位点的筛选方法，包括如下步骤，

(1)肿瘤样本选择子宫内膜癌样本，所述子宫内膜癌样本的bmi临床信息及dna甲基化的数据由tcga数据库提供，将bmi为25kg/m²作为子宫内膜癌样本分组的阈值，将bmi小于25kg/m²的子宫内膜癌样本作为对照bmi组，bmi大于或等于25kg/m²的子宫内膜癌样本作为高水平bmi组；

(2)采用limma软件包校正步骤(1)中的对照bmi组和高水平bmi组的子宫内膜癌样本的年龄、种族和肿瘤取样点三个混杂因素，并计算出显著的差异甲基化位点，fdr<0.05为具有统计的显著差异，计算结果如图1-3所示，图1为子宫内膜癌高水平bmi组和对照bmi组两组间的甲基化位点差异情况，从中筛选出差异甲基化位点，图2为上述筛选出的差异甲基化位点在基因组区域的分布情况，图3为差异甲基化位点所在基因参与的kegg(京都基因与基因组百科全书)通路；

(3)采用一般线性回归模型对步骤(1)中所获取的子宫内膜癌样本的年龄、种族和肿瘤取样点三个混杂因素进行校正，然后使用bonferroni方法对上述两组中的子宫内膜癌样本的每个dna甲基化位点的统计p值进行多重校正，设定bonferroni校正后的统计p值小于0.05的dna甲基化位点为与bmi相关的甲基化位点，筛选出与bmi相关的甲基化位点，见下表1，

表1一般线性回归模型识别与bmi相关的甲基化位点

(4)将步骤(2)筛选的差异甲基化位点与步骤(3)筛选的甲基化位点交集的甲基化位点作为候选甲基化位点，比较所述候选甲基化位点在子宫内膜癌不同分级阶段，不同临床分期，不同病理子类型和肿瘤浸润程度间的甲基化水平是否发生显著异常，p值小于0.05为具有统计的显著差异，筛选出具有统计的显著差异的候选甲基化位点，以及通过kaplan-meier及log-rank统计方法进行生存分析，评估所述候选甲基化位点对子宫内膜癌的生存率的作用是否发生显著异常，p值小于0.05为具有统计的显著差异，选择在秩和检验和生存分析中具有统计的显著差异的候选甲基化位点为所述的人肿瘤相关的甲基化位点，最终筛选出人子宫内膜癌相关的由bmi引起甲基化改变的甲基化位点cg12645852,cg0962147和cg14044785。

比较上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在高水平bmi组和对照bmi组两组间甲基化水平，结果如图4所示，在子宫内膜癌样本中，高bmi引起cg12645852,cg0962147和cg14044785三个甲基化位点甲基化水平降低；比较上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同分级阶段的甲基化水平，结果如图5所示，说明cg12645852,cg0962147和cg14044785三个甲基化位点的甲基化水平随着肿瘤分级的增加而显著升高；比较上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同临床分期的甲基化水平，结果如图6所示，说明cg12645852,cg0962147和cg14044785三个甲基化位点的甲基化水平随着肿瘤分期的增加而显著升高；比较上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌不同病理子类型的甲基化水平，结果如图7所示，说明cg12645852,cg0962147和cg14044785三个甲基化位点的甲基化水平在肿瘤的不同病理类型具有显著的差异；比较上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌肿瘤浸润程度的甲基化水平，结果如图8所示，说明cg12645852,cg0962147和cg14044785三个甲基化位点的甲基化水平随着肿瘤浸润程度升高而显著升高；将上述筛选的cg12645852,cg0962147和cg14044785在子宫内膜癌kaplan-meier进行生存分析，结果如图9所示，说明cg0962147和cg14044785甲基化高水平可显著降低子宫内膜癌病人的生存率。由上述可以得出，上述筛选的所述人子宫内膜癌相关的甲基化位点cg12645852,cg0962147和cg14044785可以作为子宫内膜癌预后诊断标志物。

实施例2

本实施例提供了一种子宫内膜癌预后诊断标志物，包括实施例1中获得cg12645852,cg0962147和cg14044785中的至少一个。进一步的，所述的甲基化位点cg12645852所在的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的甲基化位点cg09621472所在的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的甲基化位点cg14044785所在的核苷酸序列如seqidno.3所示。

实施例3

本实施例提供了一种用于子宫内膜癌预后诊断的引物，所述的引物是基于实施例2中的所述的子宫内膜癌预后诊断标志物设计的。

实施例4

本实施例提供了一种用于子宫内膜癌预后诊断的试剂盒，所述试剂盒包括实施例3中所述的用于子宫内膜癌预后诊断的引物。

实施例5

本实施例提供了一种子宫内膜癌预后诊断的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样本的基因组dna；

2)以步骤1)中的基因组dna为模板，利用实施例3的引物或实施例4所述的试剂盒进行pcr扩增；

3)测序；

4)得到dna甲基化检测结果。

根据得到的cg12645852,cg0962147和cg14044785三个位点处的甲基化水平，与实施例1中子宫内膜癌不同分级阶段、不同临床分期、不同病理子类型和肿瘤浸润程度间的甲基化水平比较，及其对子宫内膜癌的生存率的作用比较，实现对待测样本的子宫内膜癌预后诊断。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

sequencelisting

<110>中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120>一种人肿瘤相关的甲基化位点及其筛选方法和用途

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<213>人18染色体

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ga122

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<211>122

<212>dna

<213>人3号染色体

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aaacatgaatatttcagatgtctcccatcttacaaagttatcaatctgtcaaagccactc60

cgtgtgtgccggaaaatgatctggcataaaccagtcctctcagtggaggaggtcacagtg120

ac122

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<212>dna

<213>人2号染色体

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ttgggttgaaatacgataatgtttccttttgtatttaaaaaacacaaacaggatctcatc60

cggagatatcatgaccttagacattcctgagacgtctgaaagggaagtgaacatatgtca120

gc122