一种增强人脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养方法与流程

本发明属于人脐带间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种增强人脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，uc-mscs)旁分泌能力的培养方法。

背景技术：

肝脏是人体内重要的代谢器官，然而，诸如肝硬化、中毒性肝病、急性肝损伤等疾病逐渐威胁着人们的健康。目前药物治疗方法有限，外科肝脏移植是治疗终末期肝病的主要医疗手段。新兴的干细胞移植技术研究发现可以对损伤组织进行修复，成为对传统医学的一种补充手段，并被应用于肝脏疾病的临床试验中，取得了一定的疗效，为肝脏疾病的治疗提供了新途径。

干细胞是一种能自我复制并无限增殖，在特定的诱导条件下可以向多个胚层细胞分化的祖细胞。目前用于肝损伤修复的干细胞主要为胚胎干细胞(embryonicstemcells,escs)和间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)。然而，escs的细胞移植有悖医学伦理，并有多项临床研究显示escs具有致瘤性，这些都严重制约了escs的临床应用。间充质干细胞来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。mscs来源丰富，可以从若干组织中分离获得，如骨髓、脐带、脐血、脂肪组织等。uc-mscs由于含量丰富，免疫原性低，较为原始，分化能力强，对供者无不利影响等优势逐渐成为研究的重点。

间充干细胞对组织修复的方式，目前提出的主要有两种：分化替代机制和旁分泌机制，而mscs的旁分泌机制可能在组织修复中发挥着比分化替代更为关键的作用。研究表明，mscs在损伤肝脏旁分泌一系列细胞因子和信号分子，不但可通过调节免疫减轻炎症反应、抗肝细胞凋亡、促进血管增生、抗肝纤维化等修复损伤肝组织，并可促进mscs的多向分化，促进内源性肝干细胞分化并刺激内源性肝细胞增殖。但有研究发现，干细胞移植后能够到达损伤部位的细胞很少，因此提高移植细胞在损伤组织部位的旁分泌能力必将提高组织细胞的损伤修复疗效。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种增强人脐带间充干细胞旁分泌能力的培养方法，以提高人脐带间充质干细胞分泌生长因子的功能，进而提高人脐带间充质干细胞移植修复肝组织损伤的疗效。

相比于有血清培养基，添加有血小板裂解液的无血清干细胞培养基培养的uc-mscs无异种蛋白污染且不会使人体过敏，但研究发现该培养体系的细胞粘附能力会下降，而活体内mscs与靶组织细胞和细胞外基质间的粘附力是克服血液剪切力和组织牵拉力，保证其在靶点顺利归巢、增殖和分化的关键。申请人在对人脐带间充质干细胞长期培养研究过程中发现，将从小球藻中纯化的多糖组分(以下简称“小球藻多糖”)添加至无血清培养基中，可以提高uc-mscs的增殖及细胞的粘附力，同时大大提高了细胞分泌生长因子(例如神经生长因子(ngf)、肝细胞生长因子(hgf)、血管生长因子(vegf)、白细胞介素10(il-10))的功能。鉴于以上研究成果，申请人将小球藻多糖添加至无血清培养基中，从而促成了本发明。

本发明首先提供小球藻多糖在培养人脐带间充质干细胞中的应用；

本发明再一个方面提供小球藻多糖在制备用于培养人脐带间充质干细胞的培养基中的应用；

本发明实施例提供的一种具体的培养基，是添加有血小板裂解液和小球藻多糖的dmem-lg培养基；

所述的培养基中血小板裂解液与小球藻多糖的添加浓度分别为5％～30％和1～50mg/l；优选血小板裂解液与小球藻多糖的添加浓度分别为10％和24mg/l。

本发明还提供一种培养人脐带间充质干细胞的方法，是将人脐带间充质干细胞置于添加有血小板裂解液与小球藻多糖的培养基中培养。

本发明实施例提供的一种具体的培养方法，是用添加有血小板裂解液和小球藻多糖的dmem-lg培养基，在37℃，5％co2条件下对第2代人脐带间充质干细胞进行传代培养。

本发明通过将添加至dmem-lg培养基中的胎牛血清更换成血小板裂解液和小球藻多糖，对人脐带间充质干细胞进行培养，增强人脐带间充质干细胞的粘附性以及增殖能力，从而提高人脐带间充干细胞的旁分泌能力。

附图说明

图1：相差显微镜下人脐带间充质干细胞原代培养形态学表现图；

图2：相差显微镜下人脐带间充质干细胞处理培养后形态学表现图；

图3：三组培养液中ngf、hgf、vegf以及il-10水平比较图。

具体实施方法

本发明所用的材料描述如下：

bcl-2一抗、caspase-3一抗、β-actin一抗及hrp标记羊抗鼠二抗：美国sigma公司；

elisa试剂盒：购于美国rd公司；

hepg2细胞：人肝癌细胞系，购于中科院细胞库；

血小板裂解液以及小球藻多糖由本公司研制。

所检测的ngf、hgf、vegf及il-10四种生长因子的作用主要为：

ngf是一类对神经元存活、生长有营养作用的多肽小分子蛋白质，对神经元发育和损伤修复有重要作用；

hgf不仅具有肝脏损伤启动肝再生的功能，还具有显著的促细胞分裂、细胞运动、血管再生作用；

vegf能够促进内皮细胞的生长及血管的生成；

il-10是一种强大的抑制因子，具有抗炎症和免疫抑制作用。

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

本发明的人脐带间充质干细胞培养及旁分泌能力检测方法，包括如下的步骤：

1)血小板裂解液的制备：将人静脉血中加入肝素(20:1)，离心(三次离心法)获得富含血小板的血浆层(plateletrichplasma，prp)：第一次离心(200×g，5min)，吸取上层血浆和下层2-3mm红细胞层进行第二次离心(200×g，5min)，吸取上层血浆和下层1mm红细胞层进行第三次离心(800×g，10min)，可见3层分层，弃去上层大部分血清，将剩余血清、白膜样物质层和下层红细胞层混匀，即为prp，(进行血小板计数，看是否能达到1×10⁹个/ml)将获得的prp放于-80℃冰箱内保存。第2天，将-80℃冰箱中冻存的prp取出，在37℃恒温水浴中解冻(时间不能超过5min)，反复冻融(-80℃/37℃)5次，每次间隔约10min。于4℃中，4000g，15min，去除血小板细胞膜和其他细胞残片，取上清液，加入3u/ml肝素，分装30ml/管，-80℃冻存备用，即为人类血小板溶解产物。

2)小球藻多糖的提取：将小球藻或小球藻泥放入60℃的温水中浸泡，细胞壁软化并扩张；在温浴后的小球藻浆中加入果胶酶，使小球藻细胞壁发生水解反应，形成破壁藻泥；向破壁藻泥中加入3倍体积的去离子水，置于-20℃中冷冻，然后取出融化，之后4000rpm/min离心10min，取上清备用；将上清液水浴加热并浓缩至原体积的1/3，然后加入3％(体积分数)的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，6000rpm/min离心10min，取上清；于上清液中加入3倍体积的95％乙醇溶液，所得沉淀溶于水，再用体积分数为30％的乙醇进行沉淀，得到小球藻粗多糖。将小球藻粗多糖中加入适量的蒸馏水至完全溶液，然后用sephadexg-50柱层析，进一步纯化，最终获得纯品小球藻多糖。

3)无血清干细胞培养基的制备：于dmem-lg培养基中添加人类血小板溶解产物和小球藻多糖，2iu/ml的肝素(避免因为血浆中纤维蛋白原的凝集而使得培养基凝固)，青链霉素混合液100u/ml。

4)uc-mscs原代培养及鉴定：取新生儿新鲜脐带，放入含有100u/ml青链霉素混合液的dmem-lg培养基100ml中，置于4℃～12℃运输；于百级生物安全柜处理脐带，用75％医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带两端，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其中的动脉、静脉，并用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至2mm³。将剪碎的组织块均匀的放于150mm细胞培养皿中(每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体)，安全柜内静置10min(风干培养皿与组织块之间的液体)，之后将培养皿倒置放于在37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中1h(使组织块吸附于培养皿上)。之后，于培养皿中缓缓加入无血清干细胞培养基，放置于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中，培养8天(组织块长出的细胞至培养皿的50％)，取出培养皿中组织块固体，弃去。再在培养皿中加入无血清干细胞培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养至细胞80％汇合时，吸掉培养皿中培养液，加入0.25％胰蛋白酶-edta消化液6ml，静置消化2分钟，加入与消化液等体积的细胞终止液(dmem+10％fbs)终止细胞消化作用，1000rpm/min，离心5min，去掉上清，用无血清干细胞培养基重悬，即为原代培养的间充质干细胞。镜下观察细胞生长情况。

5)uc-mscs处理培养：将得到的原代培养的间充质干细胞接种至无血清干细胞培养基(含有10％血小板裂解液和24mg/l的小球藻多糖的dmem-lg培养基)中，每2天更换1次，待uc-mscs达90％融合时，开始传代培养，共传代3次。镜下观察细胞生长情况，取生长良好的细胞进行流式细胞仪鉴定。

6)uc-mscs与hepg2细胞的共培养：将hepg2细胞分为pbs组、pbs+uc-mscs^未处理组和pbs+uc-mscs^处理组。pbs组取pbs预处理的hepg2细胞(5×10⁴个/ml)2ml，置入未接种细胞的6孔板板孔中培养；pbs+uc-mscs^未处理组取pbs预处理的hepg2细胞(1×10⁵个/ml)1ml，置入接种培养的uc-mscs(dmem+10％fbs培养)(5×10⁴个/m，1ml)的6孔板板孔中；pbs+uc-mscs^处理组取pbs预处理的hepg2细胞(1×10⁵个/ml)1ml，置入接种培养的uc-mscs(无血清干细胞培养基)(5×10⁴个/m，1ml)的6孔板板孔中，每组均培养20h。

7)hepg2增殖活力检测：将各组hepg2细胞传代至p5代，待细胞生长至90％融合时，用胰蛋白酶消化，并用培养基悬浮细胞，接种至96孔板中，采用mtt法测定各组hepg2细胞490nm波长下的吸光度值。

8)hepg2细胞bcl-2和caspase-3蛋白含量测定：用胰蛋白酶消化hepg2细胞，接种于24孔板中培养，收集贴壁生长细胞，离心后加入细胞裂解液，采用westernblot检测hepg2细胞的bcl-2和caspase-3蛋白含量。

9)培养液中四种细胞生长因子水平测定：采用elisa法测定各组hepg2细胞培养液中神经生长因子(ngf)、肝细胞生长因子(hgf)、血管生长因子(vegf)、白细胞介素10(il-10)水平。

结果表明，经添加有血小板裂解液和小球藻多糖的培养液培养过的人脐带间充质干细胞6h内出现贴壁生长，细胞呈长梭形，细胞核呈圆形；培养12h出现克隆样生长；培养24h细胞生长迅速；48h细胞汇合达80％。传代培养时，细胞消化时间变长。流式细胞仪进行鉴定发现p3代uc-mscs表面cd105、cd73和cd90标志物为阳性，cd45、cd34和hla-dr标志物为阴性。pbs+uc-mscs^处理组的od490高于pbs组和pbs+uc-mscs^未处理组(p＜0.05)(见表1)。pbs+uc-mscs^处理组hepg2细胞的bcl-2表达量显著高于pbs组(p＜0.05)，高于pbs+uc-mscs^未处理组(p＞0.05)；而pbs组hepg2细胞的caspase-3蛋白表达量显著高于pbs+uc-mscs^处理组和pbs+uc-mscs^未处理组(p＜0.05)，pbs+uc-mscs^未处理组高于pbs+uc-mscs^处理组(p＞0.05)(见表2)。3组培养液中pbs+uc-mscs^处理组四种因子(ngf、hgf、vegf以及il-10)水平均显著高于对照组pbs组和pbs+uc-mscs^未处理组(p＞0.05)。

因此，经添加有血小板裂解液和小球藻多糖的培养液培养过的人脐带间充质干细胞细胞贴壁能力增强，且大大提高了增殖能力。两者的联合使用促使人脐带间充质干细胞显著提高分泌神经生长因子、肝细胞生长因子、血管生长因子、白细胞介素10水平，并能促使抗凋亡蛋白bcl-2的表达，并降低凋亡执行蛋白caspase-3的表达。因此可提高干细胞移植的疗效。

表1：三组hepg2细胞增殖情况比较

表2三组hepg2细胞bcl-2和caspase-3蛋白表达量比较