本发明属于发酵后提取领域，具体涉及一种从转化液中提取左旋多巴的方法。
背景技术：
左旋多巴又名3,4-二羟基苯丙氨酸，为白色结晶性粉末，无臭无味，在乙醇、氯仿和丙酮中不溶，在稀酸中易溶，作为一种重要的生物活性物质，左旋多巴是神经递质多巴胺的前体，可以通过血脑屏障，进入脑循环而到达中枢神经系统，在中枢神经脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加达到治疗帕金森疾病。
左旋多巴是治疗老年帕金森病的首选和最有效药物，除此之外，左旋多巴还具有治疗弱视和心力衰竭的作用，虽然在长时间的使用以后会有一些副作用，但是四十余年过去了，目前仍然没有更好的替代药物出现。目前市面上的药物或者是植物提取，或者是化学合成，但是均无法保证原料来源，产量远远满足不了市场需求，据统计，2015年左旋多巴的全球销售总额达到了3.3亿美元，在世界畅销药中排名第97位，其总产量达到了2000吨以上，预计未来5-10年全球销售总额有望达到10亿美元，随着分子生物学及生物技术的迅速发展，利用生物合成左旋多巴已经成为一种很有竞争力、前途光明的方法。
左旋多巴的生产方法有天然植物提取法、化学合成本法和微生物酶转化法。传统的制取方法是主要是从植物猫豆中提取的，中国专利cn104311440a发明公开了一种从猫豆中提取左旋多巴的方法，通过原料处理、高压提取、双水相萃取、脱盐、静置，析晶，干燥几个步骤得到左旋多巴。植物提取由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足当前市场的需求。左旋多巴的化学合成法较多，但合成法目前主要的困难就是合成出来的产品是d-型和l-型的混合物，将二者分开的过程控制难度大，同时存在生产成本高、污染环境严重等问题。微生物酶转化法就是利用代谢途径中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶、转移酶将不同的底物转变成左旋多巴，可获得大量的左旋多巴，许多国家对其进行了大量的研究，采取了许多不同的方法。
微生物酶转化法是一种反应条件温和，对环境友好的左旋多巴制备方法，然而，目前利用微生物酶法制备左旋多巴实现工业化的报道并不多见，主要是因为转化液提纯方法产生的废水较难处理。中国专利cn106117071a和cn106117072a公布了两种转化液中提纯左旋多巴的方法，但是这两个办法均没有给出提纯废水的处理方法，而这两个提取工艺的母液废水或离心废水均是含有邻苯二酚，后续处理成本较高。含酚废水危害身体健康，并造成严重的环境污染，同时废水中左旋多巴也得不到回收。因此，目前废水中含有高浓度邻苯二酚限制了左旋多巴微生物酶转化法的工业化进程。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从转化液中提取左旋多巴的方法，包括以下步骤：
a.利用酪氨酸酚裂解酶生物转化，反应结束后，加入抗氧化剂；
b.向转化液中流加无机酸，至将反应液中析出的左旋多巴颗粒完全溶解；
c.高速离心机离心收集清液；
d.加入活性炭搅拌脱色，过滤收集清液；
e.使用吸附树脂将所述清液上样吸附，稀酸溶液洗脱后，再用有机溶剂洗脱，获得左旋多巴洗脱液，再用有机溶剂洗脱，用纯化水洗脱，获得邻苯二酚洗脱液；
f.左旋多巴精制：
所述左旋多巴洗脱液浓缩后调碱结晶，过滤收集左旋多巴晶体，真空干燥获得左旋多巴成品；
g.邻苯二酚回收：
所述邻苯二酚洗脱液利用有机溶剂进行萃取转相，转相后氯化钠溶液洗涤，洗涤后浓缩结晶，干燥得邻苯二酚粉末。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述转化液的左旋多巴的起始含量为35～60g/l，邻苯二酚的起始含量为4～7g/l。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述步骤a中抗氧化剂为抗坏血酸。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述步骤b中所述无机酸选自硫酸、盐酸、磷酸、硝酸的一种或几种，所述无机酸调节转化液的ph至0.5～2.0。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述活性炭的型号选自zx301、zx862、zx720的一种或几种，所述活性炭的加量为料液体积的0.5％～3％；所述活性炭搅拌脱色时间为30～90min。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述吸附树脂为大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的型号选自x-5、h-103、nka-ⅱ中的一种。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述步骤e稀酸溶液选自稀硫酸、稀盐酸、稀硝酸的一种或几种，所述稀酸溶液的浓度为1～10mol/l，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述步骤f调碱结晶温度控制在30～50℃之间，ph调至3.0～4.5；调碱所用的碱液选自氨水溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液。
优选地，在本发明从转化液中提取左旋多巴的方法中，所述步骤g邻苯二酚萃取的有机溶剂选自甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯的一种或几种。
本发明的另一方面为提供了上述方法获得左旋多巴、邻苯二酚与左旋多巴转化液废液，使用上述方法获得的获得左旋多巴成品，左旋多巴产品含量≧99％，纯度≧99.6％，产品总杂≦0.05％,左旋多巴收率82～87％；邻苯二酚含量≧90％，回收率91～95％。
本发明摒弃了先提取左旋多巴，再处理含邻苯二酚废水的现有工艺，发明了一种在提取左旋多巴的同时回收邻苯二酚的提取工艺，减轻后续废水处理压力。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、采用大孔吸附树脂法来提取左旋多巴，在提纯左旋多巴的同时回收未消耗的邻苯二酚，使后续废水处理变得简单，大大降低了提取的成本，降低后续污水处理费用。
2、利用这种方法制备的左旋多巴产品质量好，其中左旋多巴产品含量≧99％，纯度≧99.6％，产品总杂≦0.05％，符合中国药典中关于左旋多巴的质量要求。
3、回收得到的邻苯二酚可重复利用于酪氨酸酚裂解酶生物转化制备左旋多巴工艺。
具体实施方式
本发明实施例中酪氨酸酚裂解酶生物转化方法获得左旋多巴转化液是现有技术，可所使用的常见大肠杆菌基因工程菌，如使用基因工程对酪氨酸酚裂解酶进行过优化的大肠杆菌基因工程菌；例如使用大肠杆菌基因工程菌为e.colim15，为一种常见的酪氨酸酚裂解酶优化大肠杆菌基因工程菌，可购自香港标新特有限公司。
本发明的实施例提供了一种从转化液中提取左旋多巴的具体方法，包括以下步骤：
a.利用酪氨酸酚裂解酶生物转化，反应结束后，加入抗氧化剂；
b.向转化液中流加无机酸，至将反应液中析出的左旋多巴颗粒完全溶解；
c.高速离心机离心收集清液；
d.加入活性炭搅拌脱色，过滤收集清液；
e.使用吸附树脂将所述清液上样吸附，稀酸溶液洗脱后，再用有机溶剂洗脱，获得左旋多巴洗脱液，再用有机溶剂洗脱，用纯化水洗脱，获得邻苯二酚洗脱液；
f.左旋多巴精制：
所述左旋多巴洗脱液浓缩后调碱结晶，过滤收集左旋多巴晶体，真空干燥获得左旋多巴成品；
g.邻苯二酚回收：
所述邻苯二酚洗脱液利用有机溶剂进行萃取转相，转相后氯化钠溶液洗涤，洗涤后浓缩结晶，干燥得邻苯二酚粉末。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述转化液的左旋多巴的起始含量为35～60g/l，邻苯二酚的起始含量为4～7g/l。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤a中抗氧化剂为抗坏血酸。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤b中所述无机酸选自硫酸、盐酸、磷酸、硝酸的一种或几种，更优选地，所述无机酸调节转化液的ph至0.5～2.0。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述活性炭的型号选自zx301、zx862、zx720的一种或几种，所述活性炭的加量为料液体积的0.5％～3％；所述活性炭搅拌脱色时间为30～90min。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述吸附树脂为大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的型号选自x-5、h-103、nka-ⅱ中的一种。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤e稀酸溶液选自稀硫酸、稀盐酸、稀硝酸的一种或几种，所述稀酸溶液的浓度为1～10mol/l，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤f调碱结晶温度控制在30～50℃之间，ph调至3.0～4.5；调碱所用的碱液选自氨水溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤g邻苯二酚萃取的有机溶剂选自甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯的一种或几种。
本发明的另一方面为提供了上述方法获得左旋多巴、邻苯二酚与左旋多巴转化液废液，使用上述方法获得的获得左旋多巴成品，左旋多巴产品含量≧99％，纯度≧99.6％，产品总杂≦0.05％,左旋多巴收率82～87％；邻苯二酚含量≧90％，回收率91～95％。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1左旋多巴转化液的提取工艺
a.大肠杆菌基因工程菌为e.colim15，购自香港标新特有限公司，转化反应结束后，获得转化液体积500l，左旋多巴的含量为48g/l，邻苯二酚的含量为4g/l，向转化液中加入1kg抗坏血酸，防止后续处理过程中左旋多巴和邻苯二酚被氧化；
b.向转化液中流加盐酸，调ph至1.0，搅拌至反应析出的左旋多巴颗粒完全溶解后继续搅拌30min；
c.搅拌结束后，高速离心机离心转化液，控制转速为4000rpm，温度20℃，时间30min，离心去除不溶解的菌体碎片、蛋白质等一些不溶杂质，离心后留清液，弃沉淀；
d.上清液550l，加入5.5kg活性炭脱色,型号为zx301，搅拌60min，过滤取清液；
e.准备适量h-103型大孔吸附树脂，装柱，柱体积100l，2倍柱体积4％氢氧化钠溶液冲柱，纯化水洗至中性后，再用3倍柱体积5％盐酸溶液冲柱，再次用纯化水洗至中性，处理完备用。550l清液上样吸附，控制流速10l/min。
吸附完成后，先用300l、10mol/l的稀盐酸溶液洗脱，前100l洗脱液作为废液，再用200l甲醇洗脱，控制洗脱流速5l/min，获得左旋多巴洗脱液400l，之后再用300l甲醇洗脱，最后用100l纯化水洗脱，同样控制洗脱流速5l/min，获得邻苯二酚洗脱液400l。
f.左旋多巴精制：
左旋多巴洗脱液浓缩后用10％氨水调ph至4.0，结晶，控制温度40℃，缓慢搅拌1小时待大量晶体生成后，降温至4℃，静置4h后过滤收集左旋多巴晶体，真空干燥，获得左旋多巴成品20.2kg，左旋多巴产品含量99.3％，纯度99.8％，产品总杂0.02％，左旋多巴收率84.2％；
g.邻苯二酚回收：
邻苯二酚洗脱液利用100l乙酸丁酯进行萃取转相，转相后用50l、0.5％氯化钠溶液洗涤，洗涤后浓缩结晶，真空干燥得邻苯二酚粉末1.85kg，邻苯二酚含量91％，回收率92.5％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。