本发明涉及天然产物有效成分分离纯化领域，具体涉及到一种脱氧野尻霉素的提取方法。
背景技术：
：脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin，dnj)是一种存在于桑树及其他植物和微生物中的多羟基哌啶生物碱，化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为c6h13no4，分子量为163，具有与α-1,4-葡萄糖类似的结构，是强效的α－葡糖苷酶抑制剂，具有降血糖功能，此外还具有抗肿瘤及抗病毒活性。天然脱氧野尻霉素目前已成为国际公认的用于糖尿病临床治疗的生物制剂原料，药用价值高，应用前景可观。然而，对脱氧野尻霉素进行分离纯化存在诸多困难，现有的大多数分离纯化技术由于操作复杂或工艺条件苛刻以致其效率较低，限制了脱氧野尻霉素的开发利用，难以满足医药与保健品市场的需要。尤其是大规模工业化生产天然脱氧野尻霉素的过程中需要去除植物提取液中常见的蛋白质、淀粉、色素、粘液质、果胶、树胶等杂质，这也是目前天然dnj研究与开发中的技术难点。目前报道中，结晶、酸提、正丁醇萃取、离子交换树脂、大孔吸附树脂、硅胶层析、反相层析、凝胶过滤层析、膜分离等技术都被用于纯化脱氧野尻霉素。cn103965096a公开了一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，包括以下步骤：(1)原料前处理：将干燥原料桑叶粉碎；(2)酶解：向粉料中加入水，升温，加入组合酶酶解，过滤；(3)连续组合提取：将滤渣使用3-4个提取装置连续组合提取，合并提取液，过滤；(4)醇沉、离心：减压浓缩至原体积的1/3-1/2，冷却，调节ph，加入醇溶液，搅拌，静置，管式离心；(5)膜滤：在常温压力25-35bar条件下，使用有机超滤膜进行超滤处理，然后在常温压力0.5-1.5mpa条件下，使用纳滤膜进行纳滤处理；(6)浓缩；(7)干燥。利用本发明可实现很大程度地降低溶剂损耗量、降低能耗、提高产品收率，适用于工业生产。cn103755623a公开了一种响应面法优化的酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-dnj)的方法，本发明方法用酸性乙醇溶液作为提取溶媒提取桑叶1-dnj，利用响应面法对提取条件进行优化，得到最佳提取条件为液料比为25，即25ml提取溶媒/g桑叶粗粉，在80℃条件下浸提2.7h，重提1次，滤液经纯化、浓缩后得1-dnj提取液；本发明方法可获得约0.2％的桑叶1-dnj提取率，显著高于传统的乙醇提取率0.00139％，及稀酸提取效率0.00147％，说明稀酸和乙醇在浸提桑叶1-dnj中发生了协同作用，产生了不可预见的效果，为桑叶1-dnj产品的在医药和保健品方面的开发利用提供理论支持和技术指导。cn103936664a公开了一种桑树成分的提取方法，尤其涉及桑树中脱氧野尻霉素的提取纯化方法。它包括以下步骤：水提：取桑树叶片晒干，然后加去离子水，恒温沸腾提取，过滤收集滤液，滤渣加去离子水再提取，合并滤液，加入三氯乙酸离心，得第一上清液；上柱：将所述第一上清液用反向柱色谱进行纯化，得到含有脱氧野尻霉素的液体；醇沉取上清：在上柱后所得的含有脱氧野尻霉素的液体中先加入含醇质量55-65％的乙醇搅拌3-8min，然后再加入含醇质量70-80％乙醇搅拌3-5min，得第二上清液；浓缩：将所述第二上清液浓缩后得浓缩液；微波真空干燥：将所述浓缩液微波真空干燥得到含有脱氧野尻霉素的粉末产品。本发明提取纯化提取率高、分离效果好。但是上述方法或纯度不高，或使用难处理的有机溶剂，或步骤繁多，不适于工业生产，因此，现有的脱氧野尻霉素提取方法无法提供高纯度脱氧野尻霉素并适合工业生产，本发明旨在公开一种脱氧野尻霉素的提取方法，促进脱氧野尻霉素的大规模工业化生产。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法提取得到的脱氧野尻霉素纯度高，所述方法绿色环保，易于放大，工艺简单，适于工业化生产。为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：本发明提供一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将桑树原料与水混合，超声处理，固液分离，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液进行亲和层析，使用脱附液进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行浓缩，对浓缩液进行干燥，得到脱氧野尻霉素。相对于现有技术，使用亲和层析具有高选择性，简化了制备工艺，得到的脱氧野尻霉素纯度更高，收率更高。作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述桑树原料包括桑树的树叶、树枝、树皮或树根中任意一种或至少两种的组合，所述组合典型但非限制性实例有：树叶和树枝的组合、树枝和树皮的组合、树皮和树根的组合、树根和树叶的组合或树叶、树皮、树枝和树根的组合等。作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述混合前对桑树原料进行粉碎。优选地，步骤(1)所述水与桑树原料的质量比为(5～50):1，如5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。作为本发明优选的技术方案，所述超声处理的温度为50～80℃，如50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1)所述超声处理的时间为30～60min，如30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(1)所述超声处理的次数为3～5次，如3次、4次或5次等。作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述固液分离的方法包括过滤、离心、沉降或蒸发中任意一种或至少两种的组合，所述组合典型但非限制性实例有：过滤和离心的组合、离心和沉降的组合、沉降和蒸发的组合或沉降、蒸发和过滤的组合等。作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述亲和层析的配基为葡萄糖苷酶。作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述脱附液包括乙醇。作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述对洗脱液进行浓缩的方法为减压蒸馏。优选地，步骤(3)所述浓缩过程中对脱附液进行回收。作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述干燥的方法包括加热干燥、鼓风干燥、自然干燥或冷冻干燥中任意一种或至少两种的组合，所述组合典型但非限制性实例有：加热干燥和鼓风干燥的组合、鼓风干燥和自然干燥的组合、自然干燥和冷冻干燥的组合、冷冻干燥和加热干燥的组合或加热干燥、鼓风干燥和自然干燥的组合等，优选为冷冻干燥。作为本发明优选的技术方案，所述方法包括以下步骤：(1)将桑树原料与5～50倍质量的水混合，50～80℃下超声处理30～60min，并反复超声处理3～5次，固液分离，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液进行亲和层析，使用脱附液进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收脱附液，对浓缩液进行干燥，得到脱氧野尻霉素。与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：(1)本发明提供一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法提取得到的脱氧野尻霉素提取率可到90％以上，最高可达94.7％，纯度高于99％，最高可达99.6％；(2)本发明提供一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法绿色环保，易于放大，工艺简单，适于工业化生产。具体实施方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树叶粉碎与5倍质量的水混合，50℃下超声处理3次共60min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行冷冻干燥，得到脱氧野尻霉素。实施例2一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树枝粉碎与50倍质量的水混合，80℃下超声处理5次共30min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行冷冻干燥，得到脱氧野尻霉素。实施例3一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树皮粉碎与50倍质量的水混合，80℃下超声处理5次共60min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行冷冻干燥，得到脱氧野尻霉素。实施例4一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树叶粉碎与50倍质量的水混合，50℃下超声处理3次共30min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行冷冻干燥，得到脱氧野尻霉素。实施例5一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树根粉碎与25倍质量的水混合，60℃下超声处理4次共40min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行加热干燥，得到脱氧野尻霉素。实施例6一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)将1kg桑树树叶粉碎与40倍质量的水混合，70℃下超声处理3次共45min，过滤，收集清液；(2)对步骤(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶亲和层析柱进行亲和层析，使用乙醇进行洗脱，收集洗脱液；(3)对步骤(2)得到的洗脱液进行减压蒸留浓缩，回收乙醇，对浓缩液进行冷冻干燥，得到脱氧野尻霉素。对比例1采用cn103965096a中实施例1的方法，对1kg桑树树叶中的脱氧野尻霉素进行提取，所述方法包括以下步骤：(1)原料前处理：将1kg桑树树叶粉碎，过24目筛，得粉料99.5kg；(2)酶解：向步骤(1)所得的粉料中加入600kg水，升温至50℃，然后加入200g的组合酶(纤维素:果胶酶＝4:1，w/w)，保持温度酶解5h，过滤，得滤渣；(3)连续组合提取：将步骤(2)所得的滤渣均分4份，分别置于4套提取装置中进行连续组合提取，对每个提取装置中的滤渣提取4次，每次提取溶剂为干燥原料重量9倍的体积分数80％的乙醇(含体积分数为0.4％的盐酸，盐酸的质量分数37.5％)，提取温度为85℃，提取时间为2.2h，提取后，合并提取液，过滤；(4)醇沉、离心：将经步骤(3)过滤后的提取液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为65℃，真空度为-0.06mpa，浓缩至原体积的1/3，得595kg浓缩液，向浓缩液中加入质量分数为2％的氢氧化钠溶液，调节ph为8.5，然后加入1800kg体积分数80％的乙醇溶液，搅拌15min后，静置4h，管式离心，速率为14000r/min，得离心液；(5)膜滤：将步骤(4)所得的离心液过聚碳酸酯超滤膜，压力为25-35bar，孔径为10kda，得超滤液，然后使用聚酰胺复合膜进行纳滤处理，压力为0.5-1.0mpa，孔径为600～800da，得纳滤液；(6)浓缩：将步骤(5)所得的纳滤液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为70℃，真空度为-0.08mpa，浓缩至原体积的1/6，得浓缩液297kg；(7)干燥：将所得的浓缩液进行喷雾干燥，得成品。对比例2采用cn103936664a实施例1所述方法对1kg桑树树叶中的脱氧野尻霉素进行提取。对比例3一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法除了步骤(2)采用反相层析替代亲和层析外，其他条件均与实施例1相同。对比例4一种脱氧野尻霉素的提取方法，所述方法除了步骤(2)采用凝胶过滤层析替代亲和层析外，其他条件均与实施例1相同。实施例1-6以及对比例1-4提取的脱氧野尻霉素的提取率和纯度如表1所示。表1项目提取率纯度实施例194.7％99.4％实施例291.3％99.5％实施例394.2％99.6％实施例493.3％99.5％实施例592.1％99.5％实施例694.6％99.3％对比例189.7％13.7％对比例256.8％98.3％对比例378.4％89.7％对比例466.9％54.6％通过表1看出，实施例1-6的提取率均在90％以上，最高可达94.7％，而纯度均大于99％，最高可达99.6％。对比例1采用现有技术中的一种野尻霉素提取方法，提取率为89.7％，纯度仅为13.7％，远低于本发明的提取率。对比例2采用现有技术中另一种野尻霉素的提取方法，其纯度可达98.3％，而提取率仅为56.8％，低于本发明90％以上的提取率。对比例3和对比例4分别采用反相层析以及凝胶过滤层析替代本发明采用的亲和层析的方法，野尻霉素的提取率和纯度均有不同程度的下降。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12