一种具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法与流程

本发明属于生物学领域，尤其涉及一种具有家蚕血细胞特异活性的启动子的鉴定方法。

背景技术：

家蚕是一种重要经济昆虫，具有极高的经济价值，对提高人类生存质量做出了积极的贡献。在上下五千年的悠久文明历史中，丝绸之路和丝绸文化是一块绚丽的文化瑰宝，也是中国古老文明的象征。时至今日，在当前农村经济中，蚕丝产业仍然是部分农村地区的支柱产业之一。蚕病一直是严重影响蚕丝产业的重要因素，每年因蚕病带来的经济损失约占整个产业的20％，而且没有有效的预防措施。因此，研究家蚕免疫防御机制，解析宿主对病原菌的免疫应答反应，最终能够有效防御蚕病的发生是蚕桑研究人员重要的工作内容之一。昆虫属开放式循环系统，整个体腔都浸浴在血淋巴中，血淋巴起着运输养料、激素和代谢废物，维持正常生理所需的血压、渗透压和离子平衡，参与中间代谢，清除解离的组织碎片，修补伤口，对侵染物产生免疫反应和调节体温等诸多功能。在血淋巴中，血细胞是细胞免疫应答反应的主要执行者，在免疫反应中发挥着重要的作用。根据形态，昆虫主要包含五种血细胞类型：原血细胞、颗粒细胞、浆细胞、拟绛色细胞和小球细胞，它们在免疫反应中有着不同的角色分工，共同协助昆虫应对来自体内外的各种挑战。作为一种重要的鳞翅目模式，随着基因组三部曲的顺利完成，转基因和基因编辑技术的建立与完善，家蚕成为变态与发育研究的重要材料之一。家蚕饲养方便，血细胞含量丰富，与果蝇相比具有更好的操作性，是造血及血细胞功能研究的重要介质之一。更为重要的是，鳞翅目昆虫约占据农林害虫的70％，研究家蚕造血与其调控机制，探究血细胞的功能，也可以为鳞翅目病虫害的防治提供新的策略。

综上所述，现有技术存在的问题是：家蚕免疫防御机制差，蚕病发病率高，严重影响蚕丝产业，每年因蚕病带来的经济损失约占整个产业的20％，而且没有有效的预防措施。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法，

本发明是这样实现的，一种具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法，所述具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，筛选家蚕五龄三天各组织表达芯片数据库，活动血细胞特异高表达候选基因；

步骤二，利用分子生物学手段对相关候选基因进行克隆，活动其全长cds序列；

步骤三，利用实时荧光定量pcr和westernblot等技术对候选基因在家蚕各组织中的表达情况进行详细的调查，最终确认bgibmga006002和bgibmga006150的表达具有很高的血细胞特异性；

步骤四，利用pcr技术克隆bgibmga006002和bgibmga006150启动子序列，构建至acnpv病毒表达系统后感染家蚕，初步检测各候选启动子在各组织中的活性，证实bgibmga006002和bgibmga006150启动子具有较高的血细胞特异性；

步骤五，将bgibmga006002和bgibmga006150启动子构建至转基因载体，经转基因注射和阳性个体筛选获得转基因阳性个体，利用westernblot和实时荧光定量pcr技术对这两个启动子的体内活性进行检测。

进一步，所述两个浆细胞特异性的启动子的序列为：seqidno：1和seqidno：2。

本发明的优点及积极效果为：成功获得两个血细胞特异性启动子，利用转基因操作进行进一步研究，最终确定为两个家蚕循环血细胞中的浆细胞特异性启动子；因此可以利用本发明公开的方法寻找这一类的特异性启动子，探寻和研究家蚕血液免疫系统中病原模式识别与抗病形成的分子机制；此外，也可以利用鉴定得到的家蚕循环血细胞中的浆细胞特异性启动子，对家蚕进行遗传改良，探寻和研究家蚕血液免疫系统中病原模式识别与抗病形成的分子机制，并构建转基因载体和发展家蚕转基因体系，利用这些稳定遗传的品系进行家蚕抗病品系的育种和培育，进而缩短家蚕抗病育种的年限，提高家蚕品系的抗病能力，进而挽救每年因蚕病给产业带来的行业经济损失。

本发明获得两个家蚕循环血细胞中的浆细胞特异性启动子，使转基因体系的不断完善，从而加强家蚕免疫防御机制，降低蚕病发病率。浆细胞特异表达绿色荧光蛋白，这对昆虫血细胞发育及免疫功能研究提供了便利的工具；利用浆细胞特异性启动子驱动感兴趣的基因特异性表达于浆细胞，这造血调控及基因功能研究具有重要的价值。

附图说明

图1是本发明实施提供的具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的启动子克隆和转基因载体构建策略示意图；

图中：a，家蚕bgibmga006002和bgibmga006150启动子克隆；b，转基因载体构建示意图，sp：信号肽，flag：3×flag标签，tm：跨膜结构域，serpa：sericin1基因的3’非编码区。

图3是本发明实施例提供的启动子活性报告基因egfp在各组织中的表达分析图。

图中：a和b，利用荧光定量pcr检测egfp在两种转基因个体各组织中的表达情况，其中以家蚕gapdh基因为内参；c和d，利用westernblot检测egfp在两种转基因个体部分组织中的表达情况。ep-体壁，he-头部，fa-脂肪体，mi-中肠，ma-马氏管，si-丝腺，te-精巢，ov-精巢，ha-血细胞，wi-翅原基。

图4是本发明实施例提供的报告基因egfp在五龄3天的转基因家蚕的血细胞中的表达情况。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法包括以下步骤：

s101：筛选家蚕五龄三天各组织表达芯片数据库，活动血细胞特异高表达候选基因；

s102：利用分子生物学手段对相关候选基因进行克隆，活动其全长cds序列；

s103：利用实时荧光定量pcr和westernblot等技术对候选基因在家蚕各组织中的表达情况进行详细的调查，最终确认bgibmga006002和bgibmga006150的表达具有很高的血细胞特异性；

s104：利用pcr技术克隆bgibmga006002和bgibmga006150启动子序列，构建至acnpv病毒表达系统后感染家蚕，初步检测各候选启动子在各组织中的活性，证实bgibmga006002和bgibmga006150启动子具有较高的血细胞特异性；

s105：将bgibmga006002和bgibmga006150启动子构建至转基因载体，经转基因注射和阳性个体筛选获得转基因阳性个体，利用westernblot和实时荧光定量pcr技术对这两个启动子的体内活性进行检测。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

步骤1：实验材料

步骤2：数据库、软件和在线工具

家蚕组织表达芯片数据库：http://www.silkdb.org/microarray/

中国家蚕基因组数据库silkdb：http://silkworm.genomics.org.cn/

日本家蚕基因组数据库sgp：http://sgp.dna.affrc.go.jp/index.html

美国国家生物技术信息中心ncbi：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

结构域预测在线工具smart：http://smart.embl-heidelberg.de/

基因结构分析工具splign：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi？textpage＝online&level＝form

引物设计软件：primer5.0

步骤3：实验仪器(如表1)

表1

步骤4：实验试剂(如表2)

表2

步骤5：主要溶液及配制

(1)50×tae：称取trisbase242g，na2edta·2h2o37.2g，量取57.1ml冰醋酸，加入800mlddh2o，充分搅拌溶解后，定容至1l，室温保存。

(2)1％琼脂糖凝胶：取一个干净的三角锥形瓶，加入1g琼脂糖和2ml50×tae溶液后，加水定容至100ml。用微波炉加热至琼脂糖全部融化。

步骤6：实验方法

1：家蚕血细胞特异基因的筛选与鉴定

(1)检索家蚕芯片数据库，对血细胞特异表达探针进行分析，下载其序列。

(2)将探针序列作为质询序列，在家蚕基因组数据库silkdb和sgp，以及ncbi中检索相关基因，获得其核酸序列。

(3)利用primer5.0软件设计相关引物(引物序列见表3)，所有引物均由华大基因合成。然后以家蚕血细胞cdna为模板，进行pcr扩增；

表3

(4)将pcr扩增产物经切胶回收后连接至pmd19-t载体，挑取阳性克隆送至华大测序，对测序结果进行分析比对，并设计定量引物；

(5)利用实时荧光定量pcr技术检测候选基因在家蚕五龄三天各组织中的表达情况，筛选出血细胞特异表达基因。

2：家蚕血细胞5’race模板的制备

(1)rna提取

a、将2ml无rna酶离心管置于冰上，加入10μl苯基硫脲溶液和400μl1×pbs后，用新的1ml一次性针头刺破五龄三天家蚕幼虫足部，快速收集血液；

b、血液样品3000rpm,4℃离心5分钟后，弃上层液体后加入1mlrnaiso，激烈震荡至沉淀完全裂解；

c、冰上静置10分钟后，12000rpm,4℃离心10分钟；

d、将上清液转移至新的无rna酶离心管中，加入300μl预冷氯仿后，激烈摇晃15秒，使氯仿相和水相充分混合；

e、冰上静置15分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟；

f、将上清液转移至新的无rna酶离心管中，加入300μl预冷氯仿后，激烈摇晃15秒，使氯仿相和水相充分混合；

g、冰上静置15分钟后，12000rpm,4℃离心10分钟；

h、将上清液转移至新的无rna酶离心管中，加入800μl预冷异丙醇，轻柔摇晃，使异丙醇与水充分混匀；

i、将样品在冰上静置10分钟后，12000rpm,4℃离心10分钟；

j、弃上清液，加入1ml预冷75％乙醇，轻柔重悬沉淀；

k、12000rpm,4℃离心5分钟，弃上清液，待沉淀风干后加入50μl无核酸酶水；

i、用1％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测rna纯度与浓度。

(2)rna的去磷化

a、在冰上配制反应体系：rna，2μg；10×cipbuffer，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；cip(10u/μl)，1μl；无核酸酶水，补至10μl，将所有组分混匀后瞬时离心，50℃水浴1h；

b、将液体移至一个新的预冷离心管中，加入90μl无核酸酶水并混匀；

c、加入100μl酚氯仿等比混合液，振荡混匀，在室温条件下以离心机最高转速离心5分钟；

d、将上清转移至新的离心管中，加入2μlmusselglycogen和10μl3m醋酸钠溶液，轻柔混合均匀；

e、加入220μl95％乙醇，混合均匀后，冰上静置10分钟；

f、4℃，最大转速离心20分钟，；

g、弃上清，将rna样品风干后加入7μl无核酸酶重悬。

(3)rna去帽子结构

a、在冰上配制反应体系：10×tapbuffer，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；tap(0.5u/μl)，1μl；去磷酸化na，7μl；

b、将所有组分混匀后瞬时离心，37℃水浴1h。参照rna的去磷酸化步骤中的方法对rna进行纯化，最终产物溶于7μl无核酸酶水。

(4)rnaoligo连接

a、将7μl去帽子结构的rna样品加入race试剂盒的rnaoligo离心管中，轻轻弹匀，溶解管内粉末，然后瞬时离心；

b、pcr仪中65℃处理5分钟，以去除rna二级结构，随后迅速将样品转移至冰上，静置2分钟后瞬时离心；

c、在离心管中混合一下反应体系：10×ligasebuffer，1μl；10mmatp，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；t4rnaligase(5u/μl)，1μl。将反应体系混匀，瞬时离心后37℃处理1小时。参照rna的去磷酸化步骤中的方法对rna进行纯化，最终产物溶于10μl无核酸酶水。

(5)反转录

a、在冰上配制反应体系：generacer^tmoligodtprimer，1μl；dntpmix，1μl；无核酸酶水，1μl；rna，10μl。

b、65℃，5分钟，去除rna二级结构，冰上放置2min后，瞬时离心；

c、加入预先配置好的反应体系：5×firststrandbuffer，4μl；0.1mdtt，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；superscript^tmiiirt(200u/μl)，1μl；d、混匀，瞬时离心后，50℃处理60分钟；

e、70℃处理15分钟使酶失活，冰上静置两分钟，瞬时离心；

f、加入1μlrnaseh(2u)后混匀，37℃处理20分钟；

g、瞬时离心，样品保存于-30℃备用。

s603：家蚕血细胞特异基因5’race扩增

(1)5’race扩增

a、根据测序结果，利用primer5.0软件设计5’race基因特异性引物；

b、配制第一轮pcr扩增反应体系，其反应体系为racecdna模板，1μl；generacer^tm5’primer，3μl；gsp1，1μl；10×pcrbuffer(含mg²⁺)，5μl；dntp(10mmeach)，1μl；hifitaq酶，0.5μl，最后用ddh2o补充至50μl。体系混合均匀并瞬时离心后，放入pcr仪，扩增程序为：94℃预变性2min，5个循环的94℃变性30s，72℃延伸2min；5个循环的94℃变性30s，70℃延伸2min；20-25个循环的94℃变性30s，65℃退火30，68℃延伸2mins；最后72℃处理10min，最终产物短时间保存于12℃。c、以第一轮pcr扩增产物为模板，配制第二轮pcr扩增反应体系，具体配方为第一轮pcr产物，1μl；generacer^tm5’nestedprimer，3μl；ngsp1，1μl；10×pcrbuffer(含mg²⁺)，5μl；dntp(10mmeach)，1μl；hifitaq酶，0.5μl，最后用ddh2o补充至50μl。体系混合均匀并瞬时离心后，放入pcr仪进行扩增，其反应条件为：94℃预变性2min，25-30个循环的94℃变性30s，65℃退火30，68℃延伸2min。最后72℃处理10min，最终产物短时间保存于12℃。

(2)产物检测、回收与连接

a、使用胶回收试剂盒对第二轮pcr扩增产物进行切胶回收，并用1％的琼脂糖凝胶对回收产物进行检测；

b、取4μl回收产物，加入1μlpmd19-tvector和5μlsolutionii，混合均匀瞬时离心后，室温连接16-24小时；

c、从-80℃冰箱取出感受态细胞，用手握着使其快速融化后，迅速置于冰上，并加入连接产物；

d、冰上静置30分钟，42℃水浴热激60-90秒后，迅速置于冰上，静置2分钟；e、加入400μl无抗lb培养基，37℃，220rpm于震荡摇晃1小时；

f、取出适量菌液，均匀涂布于含氨苄抗生素的lb固体培养基平板上，37℃培养过夜。

(3)阳性克隆的筛选、验证与测序

a、在超菌工作台中用白色枪头挑取单落，接种于含氨苄抗生素的lb液体培养基中，37℃恒温震荡摇晃培养4-6小时。取出扩大培养后的阳性斑，以m13f和m13r为引物，进行菌液pcr扩增；

b、取5μl菌液pcr扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，挑出阳性克隆，送至华大测序；

c、利用bioedit软件对所有测序结果进行分析，对每个基因序列进行拼接。

4：启动子克隆

(1)基因组dna的提取：参照takaraminibestuniversalgenomicdnaextractkit5.0试剂盒说明书，以家蚕(大造)血细胞为材料，提取基因组dna。利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测基因组dna的质量与浓度。

(2)启动子扩增

a、以获得的血细胞特异基因mrna5’race测序结果作为质询序列，比对家蚕基因组数据库silkdb数据库，下载转录起始位点上有约5kb的基因组序列，设计引物；

表4

b、以上面提取的家蚕基因组为模板，按照下面的扩增条件和反应体系，进行pcr扩增反应，其扩增反应体系为：dna模板，3μl；上下游引物各0.5μl；pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5μl；dntp，2μl；hifitaq，0.2μl，最终用ddh2o补充至25μl。扩增条件为：94℃预变性2min，25个循环的94℃变性30s，55℃退火30，72℃延伸1-5min。最后72℃处理10-15min，最终产物短时间保存于12℃。

c、利用1％的琼脂糖胶对扩增产物进行检测，然后切胶回收，将扩增片段连接至pmd19-tvector后，送至华大测序。

5：病毒表达载体的构建

利用三步pcr法点突变技术在pph和pp10启动子之间突变出ecori酶切位点，在xbai和hindiii之间插入dsred序列，在kpni和xhoi之间插入egfp序列。利用ecori和xbai酶切位点，将目的启动子插入病毒表达载体中。相应质粒构建完成并且验证正确后，转化至dhl0bactm大肠杆菌感受态细胞，让载体重组。提取重组质粒，pcr验证后转染至bme-swu3细胞，收集病毒，用于个体研究。

6：病毒侵染家蚕

用毛细玻璃管将收集的病毒注射至5龄1天幼虫体腔((10⁵pfu/头))，五天后分别收集包括血细胞、取丝腺和脂肪体在内的各个组织。

7：转基因载体的构建

体外合成flag-egfp-tm-serpa序列(见附录)，flag为3×flag标签，egfp为增强型绿色荧光蛋白，tm为家蚕bgibmga006002的跨膜结构域部分，serpa是家蚕sericin1基因的3’utr区域。用bglii和xbai限制性内切酶分别对合成质粒和psl1180质粒进行酶切，回收flag-egfp-tm-serpa和psl1180片段，经t4dna连接酶连接后构建成psl1180-flag-egfp-tm-serpa质粒。

以大造基因组为模板，对bgibmga006002和bgibmga006150的启动子进行pcr扩增，共用引物序列为

pint02/50-f：“cgggatcccaagaaatacacatcaacggg”，

pint02/50-r：“gaagatctatcacggcagaaagacgatc”。

产物回收后与pmd19-tvector载体进行ta克隆，得到t-pint02/50，测序验证后，用bamhi和bglii限制性内切酶进行切割，将回收pint02/50的pcr扩增产物序列与经同样酶切处理的psl1180-flag-egfp-tm-serpa的载体片段进行连接，获得psl1180-pint02/50-flag-egfp-tm-serpa。挑取单克隆接种至lb液体培养基，提取质粒后，利用bamhi和bglii进行双酶切验证，能够将启动子片段切割的质粒为psl1180-pint02-flag-egfp-tm-serpa(pint02)，不能够被这两种酶切割的质粒为psl1180-pint50-flag-egfp-tm-serpa(pint50)。最后，所有质粒经测序验证后用于下一步的操作。

用asci限制性内切酶对质粒pint02和pint50进行切割，分别切下pint02-flag-egfp-tm-serpa和pint50-flag-egfp-tm-serpa片段，连接到经过同同样酶切的pbac[3×p3-rfpafm]基础载体，构建pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]转基因载体。

8：显微注射与荧光筛选

(1)参照qiaprepspinminiprepkit超纯质粒提取试剂盒提供的造作方法，分别提取pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pha3pig质粒。

(2)将d9l非滞育品系参照第三章提供的条件进行饲养，化蛾后取雌雄蛾，交配4-6小时，拆对后产下的蚕卵备用。

(3)将重组转基因质粒与辅助质粒pha3pig等体积混匀后，注射至刚产出的蚕卵中，用无毒胶水对破损伤口进行修补，然后在在保湿盒中进行孵育催青。g0代用干净的新鲜桑叶饲养至化蛾后，自交保种。

(4)g0代蛾子产下的卵在正常条件下催青，胚胎发育5-6天后利用体式荧光显微镜筛选转基因阳性个体。g1代阳性个体单独饲养，化蛾后自交保种。

步骤7：实验结果

(1)血细胞特异表达基因的筛选

家蚕幼虫各组织表达芯片数据为筛选组织特异性基因提供了有用的工具，在本章节，分析了个不同幼虫组织和bmn细胞系中相关基因的表达情况，筛选出24个血细胞特异高表达的基因探针。将这些探针序列作为质询序列，在家蚕数据库silkdb和kaikobase中进行比对分析，获得详细的基因序列信息。经过一系列的分析、克隆和表达分析，最终筛选确定两个个候选基因，即bgibmga006002，bgibmga006150的新基因。利用实时荧光定量pcr检测了这四个基因在血细胞，头部，精巢，精巢，中肠，马氏管，体壁，丝腺和脂肪体中的表达情况，结果显示均特异高表达与血细胞。bgibmga006002和bgibmga006150表是整合素家族的两个β亚基成员，与其他整合素成员一样，其蛋白序列均由一个较大的胞外域(extracellulardomain)，一个单次跨膜结构域(transmembraneregion)和一个较短的胞内域(cytoplasmicdomain)构成。

(2)基因结构分析与启动子克隆

为了获得这两个基因的启动子序列，利用5’race技术对各基因的5’utr区域进行了pcr扩增和测序，随后对各基因染色体定位、外显子和内含子的分布情况进行了研究。bgibmga006002和bgibmga006150定位于4号染色体nscaf2847上，这两个基因在基因组上表达方向相反，中间只有841bp的间隔。根据每个基因的特点设计启动子扩增区域，其中，bgibmga006002设计了6种片段；bgibmga006150设计了3种片段。将这些片段克隆并构建至pmd19-t载体，测序正确后备用。为了初步验证启动子活性，对acnpv病毒质粒进行了改装，其中病毒启动子pp10驱动增强型绿色荧光蛋白(egfp)表达，其目的是检测病毒侵染家蚕各组织的情况。红色荧光蛋白(dsred)是一个报告基因，用于检测目的启动子的活性。在本实验中，以病毒pph启动子为阳性对照(pph)，而未插入任何启动子序列的为阴性对照(pδp)。a，候选血细胞特异基因启动子克隆示意图，彩色方框和黑色线条分别表示外显子和内含子区域，蓝色方框表示5’非编码区，短箭头表示转录起始位点，而长箭头表达克隆的启动子序列；b，载体构建示意图，目的启动子序列插在ecori和xbai之间(phs)，以在这两个位点之间插入pph启动子(pph)为阳性对照，而没有任何启动子序列(pδp)的为阴性对照。

(3)acnpv病毒系统检测启动子活性

按照方法中所描述的步骤，获得病毒并感染家蚕幼虫，五天后收集家蚕血细胞、脂肪体和丝腺进行分析。在阳性对照组pph中，在三个组织中均明显观察到红色和绿色荧光信号；而在阳性对照组pδp)中，在三个组织中至观测到绿色荧光信号而不见红色荧光信号。对于bgibmga006002基因启动子，首先从翻译起始位点开始往其上游截取了2k长度的片段(pint02-1)，但在血细胞中只检测到绿色荧光信号而无任何红色荧光信号，这说明该区域可能无启动子活性。紧接着，继续扩大研究范围，先后从翻译起始位点开始往其上游截取了3k(pint02-2)和5k(pint02-3)的长度，但遗憾的时，仍未检测到启动子的活性。因此，扩大了寻找启动子区域的范围，截取了包括第一内含子在内的多种组合(pint02-4,5,6)，其中，pint02-3范围最大，包含翻译起始位点上游2k和bgibmga006002基因的第一外外显子、第一内含子以及第二外显子的部分；pint02-4包含bgibmga006002基因的第一外显子、第一内含子以及第二外显子的部分；pint02-5只包含bgibmga006002基因的第一内含子。令人意外的是，这三种片段均显示出一定的启动子活性，在血细胞中可以明显观察到红色荧光信号，同时在脂肪体和丝腺没有检测到明显的红色荧光信号。利用类似的方法对bgibmga006150基因启动子进行分析，当截取的片段包含第一内含子区域时，在血细胞中均能观测到红色荧光信号，而脂肪体和丝腺却没有。为了研究各启动子在血细胞中的活性，利用流式细胞仪对感染的血细胞进行分析，bgibmga006002和bgibmga006150的启动子活性相对较弱。

(4)转基因载体的构建

为了最大可能获得具有活性的启动子片段，根据前期研究结果，结合这两个基因结构的特殊性，设计了从bgibmga006150第二外显子至bgibmga006002第二外显子，长度为3828bp，反相互补的两段dna序列作为这两个基因的启动子序列(图2a)。按照方法部分的描述，成功构建了bgibmga006002和bgibmga006150启动子驱动egfp表达的转基因载体(图2b)。

(5)胚胎微量注射与阳性个体筛选

分别将pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pha3pig质粒等比混匀，显微注射至d9l胚胎，g0代蚕卵正常催化孵育和饲养，通过自交获得g1代蚕种，与胚胎发育6-8天和化蚁时期进行荧光筛查。筛查结果显示，pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]组注射的200粒蚕卵中，共孵化出43粒，最终制备了18圈g1代蚕卵，并从其中两个蛾圈中筛选到阳性转基因个体，阳性率为11.1％；而pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]注射的200粒蚕卵中，共孵化出34粒，最终制备了12圈g1代蚕卵，并从其中一个蛾圈中筛选到阳性转基因个体，阳性率为8.3％。在转基因阳性个体饲养过程中，在幼虫期、蛹期和蛾期均能在眼睛中观测到明显的红色荧光信号，蛾期时荧光检测的情况，在眼睛中可以明显观测到很强的红色信号。

(6)egfp在转基因个体中的表达

将pint02和pint50两种转基因品系饲养至五龄3天时，分别收集体壁、头部、脂肪体、中肠、马氏管、丝腺、精巢、精巢、血细胞和翅原基等组织，提取rna并反转为cdna后，利用实时荧光定量pcr对egfp在两种转基因品系中的表达情况进行研究。结果显示在这两种转基因品系中，egfp均高表达于血细胞，在翅原基中有一定的表达，而在其他组织的表达水平都很低(图3a和图3b)。选取血细胞、脂肪体、中肠、体壁、丝腺、头部和马氏管等部分组织，提取蛋白后，利用flag抗体进行westernblot检测，发现在两种转基因品系中，均只在血细胞中检测到明显的条带(图3c和图3d)。收集转基因个体血细胞，在荧光显微镜下观察，可以发现有部分血细胞具有很强的绿色荧光信号，且大部分定位于细胞膜上。根据形态学观察，发现egfp阳性细胞均为浆细胞。为了进一步检测egfp在各种血细胞类型中的表达情况，对不同的血细胞类型进行分离，仍然进行定量分析，发现egfp主要表达于造血器官新释放的血细胞和循环浆细胞中，而在其他的血细胞类型中表达水平很低(图4)。同时，在荧光显微镜下对翅原基、脂肪体和丝腺组织进行观察，结果显示，在这两种转基因品系中，egfp在与翅原基紧密相连的造血器官中有荧光信号，而在脂肪体和丝腺没有荧光信号。

总之，获得两个血细胞特异性启动子，利用转基因操作其进行进一步研究，最终确定获得两个家蚕循环血细胞中的浆细胞特异性启动子。相信的研究结果不仅可以推动家蚕造血研究，还可以为昆虫相关研究提供有用的参考。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>申请人名称：西南大学

<120>一种具有家蚕血细胞特异性活性的启动子的鉴定方法

<160>2

<210>1

<211>3828

<212>dna

<213>家蚕

<400>核苷酸序列

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<213>家蚕

<400>核苷酸序列

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