一株芽孢杆菌及其在制备13C标记的乙偶姻中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其在制备¹³c标记的乙偶姻中的应用。

背景技术：

乙偶姻即3-羟基-2-丁酮，在食品、香料、化妆品、化学合成等领域有重要的用途(xiaoandlu,2014)。国内外对乙偶姻的相关应用及基础研究很多，但至今仍有非常多的问题需要研究解决，例如乙偶姻在某些细胞内的分解代谢与物质转化机制、以乙偶姻为前体合成其他化合物时的一些反应机理等等，这些问题很难用一般的方法进行研究。

同位素示踪法是利用放射性同位素或稳定性同位素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。同位素示踪所利用的放射性同位素或稳定性同位素及它们的化合物与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物(如标记食物、药物和代谢物质等)代替相应的非标记化合物。对于放射性同位素，利用它们不断地释放出特征射线的核物理性质，可以用核探测器随时追踪它们在体内或体外的位置、数量及其转变等；对于稳定性同位素，它们虽然不释放射线，但可以利用它们与相应普通元素的质量之差，通过质谱仪、核磁共振仪等分析仪器来测定。20世纪70年代以来，随着放射性同位素示踪剂对人类健康与环境的不良影响以及气相色谱-质谱联用仪等分析技术的发展，稳定性同位素示踪剂开始逐渐替代放射性同位素示踪剂(fernández-fernándezetal.2017)。

但稳定性同位素示踪剂往往价格昂贵，用一般的方法难以制备。目前国内外还没有制备¹³c标记的乙偶姻的任何报道，更没有商品化的产品，这种情况大大制约了乙偶姻的相关基础研究。

参考文献：

xiaoz,lujr(2014)strategiesforenhancingfermentativeproductionofacetoin:areview.biotechnologyadvances32:492–503.

fernández-fernándezm,rodríguez-gonzálezp,heviasánchezd,gonzález-menéndezp,sainzmenéndezrm,garcíaalonsoji(2017)accurateandsensitivedeterminationofmolarfractionsof13c-labeledintracellularmetabolitesincellculturesgrowninthepresenceofisotopically-labeledglucose.analyticachimicaacta969:35–48.

技术实现要素：

针对上述目前现状，本发明提供一株芽孢杆菌及其在制备¹³c标记的乙偶姻中的应用方法。

本发明提供的芽孢杆菌bacillussp.h-18w，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为cctccm2017346，保藏日期为2017年6月16日。

本发明提供一株芽孢杆菌，并利用这株芽孢杆菌发酵制备¹³c标记的乙偶姻。本发明提供的芽孢杆菌bacillussp.h-18w革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状。通过对本发明菌株的16srdna进行测序，并将本发明菌株的16srdna序列与eztaxon数据库中已收录的细菌模式菌株的16srdna序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16srdna序列与已知芽孢杆菌(bacillus)属菌株的16srdna序列的同源性大于99％。本发明菌株的16srdna序列已提交到genbank数据库中，登录号为mf405208。本发明菌株芽孢杆菌bacillussp.h-18w可在37–55℃温度范围内生长。

采用本发明提供的芽孢杆菌bacillussp.h-18w，发酵制备¹³c标记的乙偶姻的方法，其涉及的实施步骤如下：

第一步：活化菌株：将本发明提供的菌株芽孢杆菌bacillussp.h-18w划线接种到luria-bertani固体培养基上，置于45℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。

所述luria-bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，17g琼脂粉。调培养基ph至7.0。

第二步：制备液体种子：用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到luria-bertani液体培养基中，45℃摇床培养10h。采用体积为250ml的挡板摇瓶，装液量为50ml；采用回旋式摇床，转速设定在100rpm。

所述luria-bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。调培养基ph至7.0。

第三步：发酵生产¹³c标记的乙偶姻：将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到发酵培养基中，采用体积为250ml的挡板摇瓶，装液量为50ml；采用回旋式摇床，转速设定在100rpm。45℃发酵培养8h时停止发酵，收集发酵液，以8000rpm离心10min，收集上清液，采用气相色谱仪检测目标产物的产量。

所述发酵培养基每升中含有：10g酵母粉，10g酪蛋白水解物，20g¹³c标记的葡萄糖。

第四步：提取¹³c标记的乙偶姻：将上述步骤获得的上清液置于旋转蒸发仪中，抽真空，在45℃条件下旋转蒸发，收集馏分。用等体积的二氯甲烷对收集到的馏分萃取4次，将有机相合并，并于35℃抽真空旋转蒸发开始去除二氯甲烷。当釜底剩余物体积为旋转蒸发开始时总体积的约2％时，终止旋转蒸发过程。收集釜底剩余物并置于室温下自然挥发，继续除去产物中残余的二氯甲烷，其间用气相色谱仪检测二氯甲烷去除进度。最后，用气相色谱仪和气相色谱-质谱联用仪检测、鉴定终产物。

利用本发明所述芽孢杆菌bacillussp.h-18w，采用上述发酵方法，45℃发酵8h可以由20g/l的¹³c标记的葡萄糖产生7.5g/l的¹³c标记的乙偶姻。经过提取，最终可得纯度超过95％的¹³c标记的乙偶姻，乙偶姻的提取回收率超过30％。

本发明在国内外首次实现了制备¹³c标记的乙偶姻，极具开发应用潜力。

附图说明

图1是由芽孢杆菌bacillussp.h-18wcctccm2017346发酵制备提取所得的¹³c标记的乙偶姻产物经气相色谱仪(配置氢火焰离子化检测器)测得的纯度表征图；图2是本发明制备所得的¹³c标记的乙偶姻产物经气相色谱-质谱联用仪(配置电子轰击离子源)测得的质谱鉴定图；图3是用于对照分析的普通乙偶姻经气相色谱-质谱联用仪(配置电子轰击离子源)测得的质谱图。

具体实施方式

实施例1：菌株富集筛选与分离纯化

1.1环境样品采集

从山东省青岛市一处外窗台的灰尘中采集样品。

1.2菌株初筛

将上述样品加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降10min，然后取上清液适当稀释后涂布到luria-bertani固体培养基上，在45℃培养8–12h。挑取单菌落，经多次划线分离纯化得到纯的菌株。所述luria-bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，17g琼脂粉。调培养基ph至7.0。

1.3菌株复筛

将上述实验得到的纯的菌株，接种到复筛培养基中，在45℃摇瓶培养24h，用气相色谱仪检测产物。所述复筛培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，20g葡萄糖。调培养基ph至7.0。

经过复筛，发现1株细菌乙偶姻产量较高，将此菌株命名为h-18w，即为本发明菌株。将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、低温真空干燥法等常规方法保存备用。

实施例2：菌株鉴定与保藏

将实施例1得到的菌株h-18w进行检验，其革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状；45℃条件下，采用luria-bertani固体培养基培养8h，可得到直径大小约为2–3mm、表面有褶皱的灰白色菌落。经检验，本发明菌株h-18w可在37–55℃范围内生长。

通过对本发明菌株的16srdna进行测序，并将本发明菌株的16srdna序列和eztaxon数据库中已收录的细菌模式菌株的16srdna序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16srdna序列与已知芽孢杆菌(bacillus)属的菌株的16srdna序列的同源性大于99％，因此将该菌株鉴定为芽孢杆菌(bacillus)属。

本发明菌株芽孢杆菌bacillussp.h-18w已于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017346。

实施例3：采用芽孢杆菌bacillussp.h-18w发酵制备、提取¹³c标记的乙偶姻的方法

3.1活化菌株

将本发明提供的菌株芽孢杆菌bacillussp.h-18w划线接种到luria-bertani固体培养基上，置于45℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。

所述luria-bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，17g琼脂粉。调培养基ph至7.0。

3.2制备液体种子

用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到luria-bertani液体培养基中，45℃摇床培养10h。采用体积为250ml的挡板摇瓶，装液量为50ml；采用回旋式摇床，转速设定在100rpm。

所述luria-bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。调培养基ph至7.0。

3.3发酵生产¹³c标记的乙偶姻

将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到50ml发酵培养基中，采用体积为250ml的挡板摇瓶，装液量为50ml；采用回旋式摇床，转速设定在100rpm。所述发酵培养基每升中含有：10g酵母粉，10g酪蛋白水解物，20gd-葡萄糖-1-¹³c。45℃发酵培养8h时停止发酵，收集发酵液，以8000rpm离心10min，收集上清液，采用气相色谱仪检测目标产物的产量。

经检测，利用本发明所述芽孢杆菌bacillussp.h-18w，采用上述发酵方法，45℃发酵8h可以由20g/l的d-葡萄糖-1-¹³c产生7.5g/l的¹³c标记的乙偶姻。

3.4提取¹³c标记的乙偶姻

将上述步骤获得的发酵液上清液约50ml置于旋转蒸发仪中，抽真空，在45℃条件下旋转蒸发，收集馏分。用等体积的二氯甲烷对收集到的馏分萃取4次，将有机相合并，并于35℃抽真空旋转蒸发开始去除二氯甲烷。当釜底剩余物体积为旋转蒸发开始时总体积的约2％时，终止旋转蒸发过程。收集釜底剩余物并置于室温下自然挥发，继续除去产物中残余的二氯甲烷，其间用气相色谱仪检测二氯甲烷去除进度。

最后，得到100μl终产物，用气相色谱仪测得其纯度为95.10％(附图1)，计算得到提取回收率为33％，终产物中杂质主要为残余二氯甲烷，占2.43％。经气相色谱-质谱联用仪对照鉴定(附图2、3)，终产物确定为¹³c标记的乙偶姻，其中m/z89和90分子的丰度分别是普通乙偶姻中m/z89和90分子丰度的3.62倍和19.63倍，完全满足一般同位素示踪研究的需要。

本发明在国内外首次实现了制备¹³c标记的乙偶姻，可按实施例类似的方法扩大生产，极具开发应用潜力。