本发明属于植物基因工程领域。具体地说,本发明涉及一种通过两次突变获得的卷曲度增加突变体,利用正向遗传学及图位克隆技术克隆的水稻半显性卷叶调控基因erl1,以及利用转基因过表达实验确认该基因的功能;同时还涉及利用该基因调控叶片泡状细胞、叶肉细胞和维管束发育,通过生长素的极性分布影响叶片形态,影响叶片形态发育。可以为水稻叶片形态改良和理想株型分子设计育种提供基因资源,提高水稻产量。
背景技术:
叶片从分生组织开始生长后,其形态受近-远轴、腹-背轴、中-侧轴三个轴向发育决定。叶片极性发育决定叶长、叶宽、叶片卷曲度等叶片形态建成的主要指标。水稻叶片为等面叶,叶片中任何器官组织的发育异常都可能导致叶片形态发生改变。自2009年zhang等借助水稻叶形突变体正向克隆第一个卷叶基因sll1以来,科学家们已先后完成了20余个与叶片形态发育相关的基因的克隆及调控机制初步研究。大部分卷叶基因与近轴面泡状细胞的发育调控相关,其数目和大小的改变导致叶片出现正卷或反卷,包括acl1、roc5、rl14、oszhd1、srl1、sll2、myb103l、rel1、rel2;还有一部分基因,是通过调控近-远轴面不同组织的发育,影响叶片卷曲度,包括sll1、srl2、adl1、osago7等;此外,还有一小部分基因,如cfl1通过调控细胞质的发育而影响叶片卷曲。现已初步明确水稻叶片宽度与生长素代谢及叶片维管发育密切相关。nal7和nal1通过参与生长素的生物合成和极性运输影响叶片形态发育;而nrl1、nal2/3和rml1等基因则通过调控叶片维管组织数目和大小而影响叶片宽度。
iii类同源异形域亮氨酸锌指(hd-zip)基因家族成员是植物发育中重要的调控子。拟南芥中,有5个hd-zipiii基因家族的成员,revoluta(rev)、phabulosa(phb)、phavoluta(phv)、athb8和athb15,这5个成员对茎顶端分生组织的分化,侧生器官的极性建立和维管组织的发育具有重要的作用。水稻中,通过反向遗传研究获得hd-zipiii基因家族也有5个成员,oshb1、oshb2、oshb3、oshb4和oshb5,这些成员的极性化表达及在侧生器官发育和维管组织中作用,依赖于microrna165/166的转录后调控。在hd-zipiii功能缺失突变体中,远轴面起支配作用而sam不形成;在hd-zipiii功能获得突变体中,mir165/166结合位点发生突变时,使基因的转录产物不能被切割。
itoh等(2008)研究认为,当异位表达microrna166-resistance的oshb3,植株表现出严重的缺陷,包括产生异位的叶缘、芽和辐射状的叶片,并发现生长素能够诱导期在整个sam的异位表达,也证明了生长素引发的异位表达和叶片的发生起始缺陷有关。另有研究认为,干涉oshox33/oshb3的表达能够加速水稻叶片的衰老(栾维江等,2014)。在拟南芥中发现,kanadi基因家族的成员与hd-zipiii家族基因起相互拮抗作用,其主要在叶原基的远轴面表达。kan功能缺失突变体的叶片呈现近轴化,其中hd-zipiii基因在整个叶片中都表达;而kan过量表达会导致叶片远轴化。在叶片发育过程中,yabby基因功能表达相对迟缓,被认为在kan基因的下游。拟南芥中,在yab多重突变体中,yab基因主要在远轴面表达,呈现近轴化。但到目前为止还未有研究涉及oshb3基因对叶片卷曲度具有半显性的调控功能。
水稻叶片形态受一个复杂的遗传网络调控,目前已克隆的卷叶基因报道不多,多渠道挖掘更多的叶形调控基因资源有利于进一步解析水稻叶片形态建成的分子机理,并为水稻通过改良叶形进行理想株型分子设计育种奠定基础。
上文中涉及的参考文献如下:
栾维江,申奥,金治平,等.干扰hd-zipⅲ家族成员oshox33的表达加速水稻叶片的衰老.中国科学:生命科学,2014,44:54–65;
itohji,hibaraki,satoy,etal.developmentalroleandauxinresponsivenessofclassiiihomeodomainleucinezippergenefamilymembersinrice[j].plantphysiology,2008,147(4):1960-1975。
技术实现要素:
本发明要解决的技术问题是提供一种从两次突变获得的卷曲度增加突变体克隆的新基因erl1,该基因编码的功能蛋白,通过调控叶片泡状细胞、叶肉细胞和维管束发育,增加叶片的卷曲程度,影响叶片形态发育。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种水稻半显性卷叶调控基因erl1编码的蛋白质,该蛋白质具有seqidno:2所示的氨基酸序列。
作为本发明的水稻半显性卷叶调控基因erl1编码的蛋白质的改进:氨基酸序列还包括在seqidno:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种中的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
本发明还提供了编码上述蛋白质的基因,该基因具有seqidno:1所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的改进:核苷酸序列还包括在seqidno:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供了含有上述基因的质粒。
本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞,该宿主细胞含有上述基因序列,该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还提供了上述基因的用途:用于构建转基因水稻,所述转基因水稻的叶形得以改良,水稻叶片发生卷曲。所述转基因水稻的叶片对不同的erl1的表达表现出不同度的卷曲程度和植株高度。
本发明还提供了一种改良水稻叶形的方法,包括用为seqidno:1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞,再将转化后的水稻细胞培育成植株。转化可采用农杆菌介导法或基因枪法。
具体的说:本发明所提供的从两次突变的水稻叶片极卷突变体中正向克隆的新基因erl1,具有seqidno:1所示的核苷酸序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因,还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。
本发明中seqidno:3所示的蛋白质,还包括其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。
本发明所提供了含有seqidno:1所示序列的基因或含部分该基因片段的载体,如图4所示,该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。
本发明利用卷叶突变体通过图位克隆正向获得的调控叶片卷曲的基因erl1,通过序列比对,发现erl1与oshb3基因等位。
实现本发明的具体技术步骤如下:
一、水稻叶片极卷突变体erl1的分离和遗传分析
本发明所采用的水稻叶片极卷突变体(extremerolledleaf,erl1)是将粳稻品种(japonica)“日本晴”背景的卷叶突变体sll1经1%浓度的化学诱变剂(ethylmethanesulphonate,ems)处理,与野生亲本日本晴杂交之后产生f1代自交产生的f2代群体,借助测序分析和分子标记,分离获得不含sll1位点突变的表型稳定的水稻极卷叶突变体erl1。该突变体叶片宽度变窄、极卷,呈细卷叶状,其如图1所示。极卷突变体erl1与籼稻台中本地1号(taichungnative1,tn1)杂交f1代自交产生的f2代群体共576株,其中正常叶为138株,半卷叶为273株,极卷叶165株,经卡平方测验,正常叶、半卷叶与极卷叶个体的分离比符合1:2:1,表明本发明所得到的水稻极卷叶片突变表型是一个符合单基因控制的半显性遗传性状。对erl1和杂合突变体及野生型的剑叶中间做石蜡切片,对组织结构进行观察比较分析,发现erl1叶片的泡状细胞、叶肉细胞、厚壁细胞与维管束排列等都发生了明显的变化(如图2)。
二、图位克隆控制水稻极卷叶erl1基因
1、erl1基因的初步定位
为了分离erl1基因,本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体,由极卷突变体erl1与籼稻品种台中本地1号(taichungnative1,tn1)杂交后自交而形成的f2群体,再通过图位克隆的方法,并利用sts、ssr等分子标记对erl1位点进行初步定位,将其初步定位在第12染色体长臂上,并介于rm5479和rm1226两标记之间(图3)。
2、erl1基因的精细定位及候选基因确定
通过对籼稻品种9311和粳稻品种日本晴进行序列比对分析,发展了8个新的sts分子标记(表1),将erl1精确定位于sts标记serl-5和(f:gaagccttcgccgtctct;r:aggagaagtagggagaggttgg)和serl-8(f:agggatcaaaagtctgaaacca;r:gctgcatatgatcttgttgttga)之间,55kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(orf),将erl1基因确定于bac克隆oj1257_b09的14655-20783的位置(图4)。
3、erl1基因的鉴定和功能分析
利用pcambia1300改造的p1300s载体构建erl1过表达载体。构建步骤:pcr扩增获得全长为2568bp的cds序列,将该片段连接到1300s载体2×35s启动子后的多克隆位点xbaⅰ和salⅰ之间,获得p1300s::erl1过表达载体(图5)。
通过转基因技术,进行过量表达转基因研究,结果表明本发明获得了使正常叶片形态的野生型水稻的叶片卷曲的转基因水稻(图6),证明了本发明正确克隆了erl1基因,明确erl1基因cdna序列(seqidno:2),氨基酸序列分析表明erl1基因编码一个带有start结构域(甾类激素快速合成调节蛋白相关的脂类转移结构域)的蛋白(seqidno:3),首次发现erl1基因的过量表达能使水稻叶片的卷曲度和株高发生改变。erl1的表达量越高,叶片卷曲程度越高。极卷叶突变体erl1植株矮小,叶片极端卷曲的窄叶表型。杂合型突变体的突变位点为aa,极卷叶突变体erl1的突变位点为aa。
综上所述,本发明从水稻极卷叶突变体erl1中克隆并鉴定了控制水稻叶片卷曲程度的基因,将其命名为erl1,并通过表达实验进行基因功能验证。在水稻中,erl1基因功能过表达导致叶片泡状细胞、叶肉细胞、厚壁细胞和维管束发育异常,造成叶片呈极端的卷曲表型。图位克隆的结果表明,该基因编码的功能蛋白,通过调控泡状细胞、叶肉细胞、厚壁细胞和维管束发育。erl1基因克隆对了解泡状细胞和维管束的分化发育,以及单子叶植物叶片的极性建成等方面有重要的理论价值。叶片是水稻进行光合作用主要场所,其形态建成及空间伸展姿态是理想株型的重要组成部分。叶形发育与植株耐热抗旱等抗逆特性及产量密切相关。该发明可以为水稻株型改良和分子设计育种提供新的基因资源和理论指导。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为日本晴(erl1)、杂合体(erl1/erl1)及水稻极卷叶突变体erl1植株表型图;
图2为日本晴(erl1)、杂合体(erl1/erl1)及水稻极卷叶突变体erl1叶片细胞结构图;
图3为半显性卷叶基因erl1在水稻第12染色体上的初定位图;
图4为半显性卷叶基因erl1在水稻第12染色体上的精细定位图;
图5为过表达载体p1300s::erl1(12.9kb)质粒图谱;
图6为半显性卷叶基因erl1过表达转基因植株表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:
1.水稻材料
水稻(oryzasatival.)极卷叶突变体erl1(extremerolledleaf1),是将粳稻品种(japonica)“日本晴”背景的卷叶突变体sll1经1%浓度的化学诱变剂(ethylmethanesulphonate,ems)处理,与其野生型粳稻品种日本晴杂交之后产生f1代自交产生的f2代群体,借助测序分析和分子标记,分离获得不含sll1位点突变的表型稳定的水稻极卷叶突变体erl1。该突变体叶片宽度变窄、极卷,呈细卷叶状,其如图1所示。对erl1和杂合体及日本晴的剑片中间做石蜡切片,对组织结构进行观察比较分析,发现erl1叶片的泡状细胞、叶肉细胞、厚壁细胞与维管束排列等都发生了明显的变化(如图2)。
2.分析和定位群体
纯合的极卷突变体erl1与籼稻台中本地1号(taichungnative1,tn1)杂交f1代自交产生的f2代群体共576株,其中正常叶为138株,半卷叶为273株,极卷叶165株。选择与突变体表型一致的165个极卷叶单株作为定位群体,对半显性极卷叶调控基因erl1进行定位。在分蘖期每株取1克左右的嫩叶,用来提取总dna。
3.ssr和sts标记定位erl1基因
采用改良的ctab法提取水稻叶片用于基因定位的基因组dna。取3-5cm水稻叶片,剪碎放入2.0mleppendorf离心管中,加入1粒钢珠,700ul提取液,置于tissuelyseriisystem组织研磨器,研磨2-3min,65℃恒温水浴40-60min,再用氯仿萃取,吸取上清液,加入等量冰冻的异丙醇,离心,用70%酒精洗涤,晾干即可加入150μl超纯水作为dna样品。每一个pcr反应用2-3μldna样品。
erl1基因的初步定位:在erl1与tn1组合的f2群体中各单株按叶片表型分成平展、半卷和极卷3类后,组成的小群体进行ssr分析,根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱,选取近似均匀分布于各条染色体上的ssr引物,利用mjresearch的ptc-200型梯度热循环仪进行pcr扩增,pcr扩增反应总体积为20μl,其中包括50mmol/lkcl,10mmol/ltris-cl(ph9.0),1.5mmol/lmgcl2,200μmol/ldntp,50-100ng的基因组dna,1个单位的taq聚合酶和0.1μmol/l引物,其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性4min,进入循环扩增:94℃变性30s,各引物及其退火温度见表1,退火时间30s,72℃延伸30s,循环40次;72℃延伸10min。经5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(eb)染色,检测pcr产物的多态性。最终将erl1初步定位在第12号染色体长臂rm5479和rm1226两分子标记之间(图3)。
erl1基因的精细定位:扩大在erl1与组合的f2群体,选取869株极卷叶突变体(包括初定位的165株),在初定位的基础上继续设计sts标记,通过对籼稻品种9311和粳稻品种日本晴进行序列比对分析,发展了8个具有多态新的分子标记(表1),即,具体为serl-1、serl-2、serl-3、serl-4、serl-5、serl-6、serl-7、serl-8。
利用东盛.龙的edc-810型pcr扩增仪进行pcr扩增,pcr扩增反应总体积为20μl,其中包括50mmol/lkcl,10mmol/ltris-cl(ph9.0),1.5mmol/lmgcl2,200μmol/ldntp,50-100ng的基因组dna,1个单位的taq聚合酶和0.1μmol/l引物,其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min,进入循环扩增:94℃变性30s,各引物及其退火温度见表1,退火时间30s,72℃延伸30s,循环35-39次;72℃延伸10min。经4%-5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(eb)染色,检测pcr产物的多态性。
最终将erl1精确定位于oj1257_b09的bac上,位于分子标记serl-5和serl-8之间共55kb的范围之内(图4)。初定位和精细定位的分子标记序列如表1所示。
表1、用于基因定位的分子标记序列
注:**为用于初定位标记;*为用于精细定位标记;“t”为sts标记;“s”为ssr标记。
4、erl1基因预测、cdna全长基因的获得与功能的预测:
根据精细定位的结果,在55kb范围内结合基因预测网站riceautomatedannotationsystem(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)的预测,发现在此区间共包含7个开放阅读框(orf),并设计测序引物(见表2)进行测序,利用seqman软件对野生型和极卷叶突变体erl1的测序结果比对,结果表明,位于bac克隆oj1257_b09上第7个orf的外显子上(16739位点)存在1个由g到a的单碱基突变(图4),导致由甘氨酸到谷氨酸的变异。根据bac克隆oj1257_b09序列的基因注释信息(ncbi),预测基因编码一个带有start结构域(甾类激素快速合成调节蛋白相关的脂类转移结构域)的蛋白。通过调控水稻叶片泡状细胞、叶肉细胞、厚壁细胞和维管束发育,影响叶片的卷曲程度。erl1基因包含6129bp的核苷酸序列(即,erl1gdna序列),如seqidno:1所示。经过pcr扩增得到了erl1基因的2568bpcdna全长序列(seqidno:2)。其与野生型相比,有1个g到a的单碱基突变。
该水稻半显性卷叶调控基因erl1编码的蛋白质具有seqidno:3所示的855个氨基酸序列,“*”表示终止密码子(tga)。
表2、用于候选基因测序的引物及其pcr退火温度
实施例2:过表达erl1基因改良水稻叶形的方法
以粳稻品种“日本晴”cdna为模板,用引物erl1-ov-f:5'-tgctctagaatggcagcggcggcggtggggg-3'和erl1-ov-r:5'-acgtcgactcacatgaaggtccagttgacg-3'扩增(pcr扩增反应体系为:cdna模板5μl,前引物1μl,后引物1μl,kodfx酶1μl,2×kodpcrbuffer25μl,dntp(2mm)10μl,ddh2o7μl,总共50μl。扩增条件为:94℃预变性5min,进入循环扩增:98℃变性10s,62℃退火30s,68℃延伸3min,循环35次;68℃延伸10min),获得2568bperl1基因片段(如seqidno:2所述),将该片段连接到1300s载体2×35s启动子后的多克隆位点xbaⅰ和salⅰ之间,获得p1300s::erl1过表达载体。
具体步骤为:首先,用kod-fx酶对日本晴的erl1cdna进行扩增,连接中间载体pmd19-t,测序,获得正确克隆erl1-cdna-t;其次,用takara的限制性内切酶xbaⅰ和salⅰ对载体erl1-cdna-t和p1300s分别进行双酶切,t4dna连接酶16℃过夜进行连接反应,热激转化到dh5a大肠杆菌中,鉴定阳性质粒,得到该基因的过表达载体p1300s::erl1。质粒p1300s::erl1通过电击的方法转入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)株系eha105中转化水稻。分别利用粳稻品种“日本晴”成熟胚诱导的愈伤组织,经过诱导培养基培养2周后,挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有质粒p1300s::erl1的eha105菌株侵染水稻愈伤,在黑暗、28℃条件下共培养3天后,在含有50mg/lhygromycin和400mg/l羧苄的筛选培养基上光照培养14天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株株系erl1-over-1和erl1-over-2。对植株进行鉴定和连续的观察,发现转基因水稻产生了与杂合型突变体类似的叶片半卷曲表型,而且不同的erl1表达量表现出不同的叶片卷曲程度和植株高度(图6)。
图6中的erl1-over-1为erl1过表达转基因株系1;erl1-over-2为erl1过表达转基因株系1;erl1-over-1的表达量相对野生型武运粳7相比为448.55,erl1-over-2的表达量相对野生型武运粳7相比为313.95。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
<110>中国水稻研究所
<120>水稻半显性卷叶调控基因erl1及其应用
<160>3
<210>1
<211>6129
<212>gdna
<213>水稻(oryzasativa)
<400>1
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