本发明涉及生物技术基因甲基化检测，具体是一种无创高通量甲基化结肠癌诊断、研究和治疗方法。
背景技术：
近年来,表观遗传学研究已经成为癌症研究的一个新方向。1983年,科学家们首次发现dna甲基化与癌症之间存在着密切的关系。riggs和jones发现,相对于正常细胞而言,癌细胞基因组呈现出低甲基化。基因组dna上各cpg位点甲基化状态的差异构成基因组dna甲基化谱，基因组dna异常甲基化会导致人类多种疾病的发生和发展。大量研究结果显示,表观遗传修饰的异常改变与癌症有着十分密切的联系,全基因组范围内的表观遗传修饰改变已经成为癌症的新标记。最新的观点认为,癌症的发生发展不仅仅与遗传改变相关,表观遗传修饰的异常改变也贯穿于癌症的各个阶段。因此,这就意味着癌症在一定程度上是一种表观遗传疾病。dna甲基化作为表观遗传修饰的重要组成部分,其在癌症的早期诊断、治疗、预后以及预防等方面的研究也取得了相应的成果。世界卫生组织指出，三分之一的癌症可以预防，三分之一的癌症可以治疗，要想预防和治疗，就必须要早期诊断，早期诊断、早期治疗不但可以节省大量花费，更重要的的是大大提高病人的生存率。现在多数肿瘤检测是针对基因突变或者重组的，对用药有指导意义(比较简单)但不能检测早期肿瘤。
结肠直肠癌(crc)是常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌。在我国常见恶性肿瘤死亡中，结直肠癌患者在男性占第五位，女性占第六位。近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，同时，其发病年龄趋向老龄化。在美国是第四大最常见的癌症，但是，它是癌症相关死亡的第二大原因。高死亡可能是由于下列事实：1)5年生存率显着下降，从约90％的患者诊断为局部疾病到70％和12％的患者分别被诊断为区域和远期阶段疾病；2)只有约40％的患者在早期阶段被诊断。3)只有约一半的50岁及以上的成年人已被筛选。表观遗传改变，包括甲基化，在crc的发病机制中发挥作用。循环甲基化dna参与细胞分裂和细胞周期控制，已被鉴定可作为这样的标记物。
直到目前为止技术上的限制，科学家和实验室里还只能对单一类肿瘤进行早期筛查，实现这种高灵敏度高准确的一次检测早期诊断所有肿瘤的技术，目前仍有许多技术难点。尤其目标甲基化位点的富集，现在市场上没有甲基化下一代测序的完整解决方案。对于具有临床意义的甲基化位点的解读需要通过大量临床研究获得，这些位点对于检测的准确性至关重要。目前还没有成熟的方法和可靠的数据解读这些测序资料。有两个问题涵待解决，一是测序后得到大量信息如何分析，二是分析得出结果，与临床是否符合，与病情是否符合。总之，虽然dna甲基化检测是公认的早期癌症检测方法，但是因为目前技术在灵敏度和准确性上都达不到临床使用的地步。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种无创高通量甲基化结肠癌诊断、研究和治疗方法，基于高通量基因甲基化的下一代测序技术，鉴定与特定结肠癌症相关的基因中甲基化模式，能够早期发现人体内结肠器官的肿瘤。
一种无创高通量甲基化结肠癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供所用组合物来自受试者的生物样品及包含的基因组dna，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序m-ngs同时加上血液中的cfrna信息：鉴定与结肠癌症相关的基因中甲基化的变化，检测受试者的生物样品一个或多个基因中dna甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，包括建立sept9，mlh1，dkk2，apc基因含有的特异性cpg岛位点，使用特异性的抗甲基胞嘧啶抗体识别并结合到发生甲基化的dna片段，利用免疫沉淀技术达到富集的效果，来实现甲基化二代测序文库的建立和靶标位点的富集，并将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较,对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理分析得出结论受试者是否有癌症,进而结合来自无细胞核糖核酸cfrna的基因信息和甲基化位点的综合分析，确定癌症的发生以及定位。
本发明突出贡献：
本发明方法发展了基于基因甲基化的下一代测序技术的应用，通过cfrna和甲基化谱的结合来实下一代测序文库的建立和靶标位点的富集，能够早期发现人体内特定器官或部位的肿瘤。现在美国做早期肿瘤血检的只有比尔盖兹投资的grail，但是本发明方法与他们不完全一样，另外，grail也没有同时检测cfrna，不知道基因表达情况，因此其结论与临床准确性符合程度受到影响。并且他们的数据库建立因为病人数量不充足的影响，基础样本数目规模也会受到限制，因此与比尔盖兹投资的grail的竞争对手可以忽略不计。本发明的技术是基于大通量平行甲基化检测组合测序，在本行业里处于领先地位，同时加上cfrna信息分析方法，从而更准确的确定早期发现癌变的部位，在肠癌上已经有83％的准确率，对广谱肿瘤诊断如虎添翼。众所周知，基因的开关必须由rna来判断，dna甲基化只是上游信息。只有把这两个方面信息结合起来，敏感度和准确度才能都达到非常好的程度。
简言之，该基因甲基化技术具有独特性和前瞻性，能够预测早期结肠肿瘤的发生。市场上还没有专门针对早期肿瘤筛查的基于甲基化的广谱肿瘤下一代测序方案，本发明方法证实已经找到突破口，并取得了成功。
附图说明
图1为在结肠中sept9，mlh1，dkk2，apc的总体甲基化百分比示意图。
具体实施方式
本发明的无创高通量甲基化结肠癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供来自受试者的生物样品及包含的基因组dna，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序同时加上血液中的cfrna信息：鉴定与特定癌症相关的基因中甲基化的变化，检测生物样品的一个或多个基因中dna甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，以及将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较，其中标准甲基化谱选自于非癌性样品的甲基化谱和癌性样品的甲基化谱，进而结合来自无细胞核糖核酸cfrna的基因信息和甲基化位点的综合分析，确定癌症的发生以及定位。
本发明的cfrna信息技术：利用血液中游离的肿瘤细胞释放的rna，能够强力抵抗血液中的核糖核酸酶的降解，并且存在足够的水平以便进行定量分析这个特性，并且这些循环的rna在结肠癌症患者的血清和血浆中与健康人的相比明显上升，通过它们获得的基因信息，结合受试者的甲基化图谱的结果，进而给出确切的诊断结果。
本发明所述无创高通量甲基化结肠癌症的诊断方法，提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品，包含的基因组dna，其特征在于把鉴定该基因在启动子区域的cgi岛和cpg岛中的甲基化水平作为结肠癌的诊断标志物和临床靶标，当存在甲基化水平增加时，对应的就是所述基因的表达降低。为筛选受试者中结肠癌的存在的具体方法：包括(a)从来自受试者的生物样品中提取基因组dna,随后对其进行亚硫酸氢盐转化；和(b)检测基因甲基化是在基因的5`非翻译区中，使用体外测定法高通量二代测序仪检测所述基因sept9，mlh1，dkk2，apc的甲基化状态，在所述受试者的受试样品中，上述基因的甲基化程度相对于正常结肠细胞比照，指示结果显示甲基化水平升高的则是结肠癌。
本发明还提供了进一步的一种诊断结肠癌症的方法，癌症的表征包括确定疾病存在或不存在的机会。图1显示了在结肠中sept9，mlh1，dkk2，apc的总体甲基化百分比。检测的结果显示，为分数20/22也就是图1中90.9％，结肠癌血液样品显示四个基因组启动子区域的高甲基化，而在正常0/3没有甲基化发生，良性邻近组织5/7，只有两例有些微的低甲基化中没有检测到高甲基化。
在更进一步的实施方案中，癌症的表征包括确定发生转移性疾病的风险。在其它实施方案中，癌症的表征还包括监测所述受试者的疾病进展情形。把上述检测方法得到的检测结果，用下面诊断方法算法计算之后，得到癌症的表征风险评价，从而给出受试者的癌症发生的准确结论。
本发明提供了表征定性结肠癌症的方法，包括提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品及包含的基因组dna，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序同时加上血液中的cfrna信息，建立sept9，mlh1，dkk2，apc基因含有的特异性cpg岛位点，检测sept9，mlh1，dkk2，apc基因中dna甲基化的存在与否，从而表征受试者是否有癌症。
本检测的适用对象是50岁以上的高风险男性，检测的平台是二代测序仪，检测这四个基因为sept9，mlh1，dkk2，apc。10毫升血液离心后取上清抽提游离dna。然后利用亚硫酸氢盐转化把甲基化的cpg岛转化为cc的序列，然后建构测序文库进行大通量平行测序。通过对测序结果的分析读取基因特定区域甲基化的密度来判断是否病人已经患有结肠癌。经检测血液中4个基因特定区域的甲基化水平符合下述诊断算法，诊断为早期的结肠癌。在进一步的实施方案中，本检测的阴性准确率达到96.3％可以有效排除检验对象患结肠癌的可能性。
在一些实施方案中，生物样品是活组织检查样品。在其他实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，dna甲基化包括cpg甲基化。在一些优选的实施方案中，检测dna甲基化的存在或不存在，包括用甲基化敏感性限制酶消化所述基因组dna，随后对含有cpg岛的特异性dna片段进行多基因扩增。在一些实施方案中，甲基化敏感性限制酶包括hin61.在其它实施方案中，甲基化敏感性限制酶包含hpah。
本发明还提供了一种诊断癌症的方法，包括提供来自受试者的生物样品，所述生物样品包含的基因组dna；并检测sept9,mlh1,dkk2,apc基因中dna甲基化的存在与否，从而诊断受试者的癌症。在一些实施方案中，所述方法还包括检测一种或多种基因中存在或不存在dna甲基化的可能性，包括si00,srbc,ralgds,hdsfl,sy,cyclind2,tms1,hic-1,hmlhl,rab6c,e-cadherin,14-3-3sigma,igf2,sfrp5和mdgi基因。在一些实施方案中，通过下面诊断方法算法得知受试者处于发展为癌症的高风险中。
甲基化二代测序方法
a.将5微克从lncap细胞分离的基因组dna超声处理至
诊断方法算法：sept9,mlh1,dkk2,apc的dna甲基化模式将用下式计算：
诊断危险因素＝4个基因中的总甲基化cpg岛/4个基因中的总cpg岛。
诊断方法：如果这个数字小于0.15，患者就没有任何结肠癌风险。
如果这个数字在0.15-0.3之间，患者被诊断为早期癌症的风险很高。
如果这个数字超过0.3，那么患者被诊断为t2期或以上的风险很高。
解释技术名词：高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，因此称其为下一代或二代测序技术(nextgenerationsequencing)，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。
蛋白a树脂珠粒即invitrogen，carlsbad，california。
所述试剂盒zymoresearch，orange，california是购买的。
bio-analyzer即是agilenttechnologies，santaclara，california。