一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗体线性表达框，具体涉及一种可以高通量表达单克隆抗体的线性表达框。
背景技术：
：自20世纪80年代以来，单克隆抗体与基因工程抗体技术取得了快速的发展。抗体技术经历了鼠源杂交瘤、噬菌体展示抗体文库技术、核糖体展示抗体文库技术、eb病毒转化b细胞永生化技术、流式分选单个b细胞技术(singlecellsorting)等，使得制备抗体的方式呈现多元化，每个方法都在不断完善相关技术细节，从而使得抗体制备显得相对容易。目前抗体研究方向已从最初的鼠源抗体转向了人源单克隆抗体和基因工程抗体，从专注于单个抗体的功能到研究整个抗体组学的相关信息。同时，随着晶体衍射和冷冻电镜技术的发展，抗体的抗原识别位点和抗体-抗原复合物的三维结构也成为目前研究的一个热点。此外，现阶段大量抗体药物的上市，治疗型抗体也成为一个快速发展的行业。基因工程抗体技术都需要对抗体基因进行克隆和表达，并从海量的待选抗体中筛选出功能特异的目标抗体。高通量构建抗体表达系统和抗体的高通量表达是实现高通量筛选的基础。传统的抗体表达需要将抗体基因克隆到真核表达载体中，然后将真核表达质粒转染到宿主细胞中进行抗体的表达。每个抗体需根据抗体可变区的序列设计两对独特引物，pcr扩增轻链和重链基因，切胶回收基因片段后经特异性酶切位点与表达载体连接、转化感受态菌。然后挑取单个菌落测序，筛选阳性重组克隆，再制备质粒，瞬时转染细胞表达抗体。此过程是一个完整的分子克隆，步骤繁琐，耗时较长，无法实现高通量操作。由于前期筛选的抗体或者单个b细胞的特异性不高，有活性的目的抗体的数量只占全部表达抗体很少的一部分。这使得目的抗体的获得不但费时费力，而且试剂耗材消耗量巨大，前期成本比较大，且实验成功率较低。综上所述，目前制备抗体的方法较多，且比较成熟。而抗体的高通量表达和筛选技术非常单一，从出现基因工程抗体以来，似乎从来没有出现过革命性的变革。不但步骤繁琐、耗时耗力，而且成本很高，最主要是无法实现抗体高通量的表达和筛选，成为制约抗体技术发展的瓶颈。技术实现要素：为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种诱导抗体快速少量表达的线性表达框，以满足对抗体快速高通量表达以及前期初筛的需求。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗体线性表达框，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达元件：翻译启动子、抗体信号肽编码序列、抗体重链可变区编码序列、连接区编码序列、抗体轻链可变区编码序列、终止子。进一步，所述翻译启动子可以是选自组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、响应于生理信号的启动子或可调节启动子中的任意一种，只要可以启动抗体表达的启动子即可。适用于控制抗体编码序列表达的组成型启动子的实例包括但不限于鸡r一肌动蛋白(cb)或来自其他种类的r肌动蛋白启动子、人巨细胞病毒(cmv)启动子、猿猴病毒40(sv40)的早期和晚期启动子、u6启动子、金属硫蛋白启动子、efla启动子、泛素启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子，腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子、p-肌动蛋白启动子、单纯疽疹病毒的胸普激酶启动子以及本领域技术人员己知的其他组成型启动子。其他启动子可以包括例如人巨细胞病毒(cmv)立即-早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、jc多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白((mbp)或神经胶质元纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疤疹病毒(hsv-1)潜伏相关启动子((lap)、劳氏肉瘤病毒(rsv)长末端重复序列(ltr)启动子、神经元特异性启动子((nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑素浓集激素((mch)启动子、cba、神经胶质元纤维酸性蛋白(gfap)启动子、基质金属蛋白启动子((mpp)、以及鸡p-肌动蛋白启动子。在本发明的具体实施方案中，所述翻译启动子是cmv立即-早期增强子/启动子，序列如seqidno.1所示。进一步，所述抗体信号肽的序列是抗体翻译过程中的前导序列，mrna转录完成以后，信号肽在核糖体上首先被翻译出来，然后结合信号肽识别颗粒，信号肽识别颗粒将核糖体携带至内质网中继续翻译下游的抗体成分。在信号肽的引导下，新合成的抗体蛋白进入内质网腔进行翻译后修饰，而信号肽序列则在信号肽酶作用下被切除。抗体的信号肽作用如下：1)信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞；2)信号肽的疏水核心决定蛋白质的分泌效率；3)信号肽能够引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确的定位；4)信号肽能够分泌增强子增强外源蛋白的分泌；5)短的信号欣有利于减少表达载体的分子置，提高整合到宿主染色体上外源基因表达盒的。信号肽在抗体分泌表达过程中起着至关重要的作用，直接影响抗体表达量和翻译后修饰作用。信号肽对抗体分泌的影响非常巨大，不同的抗体家族(如重链的igg1,2,3和轻链的kappa和lambda)对各自的信号肽又有不同的偏好。已有大量的关于某一抗体信号肽对抗体表达量的影响的报道。本发明选择的信号肽是一种抗体通用型信号肽，其特点在于对抗体轻重链家族没有选择性，能够最大限度的将所有目标抗体携带进入内质网进行翻译后修饰。在本发明的具体实施方案中，所述抗体信号肽编码序列如seqidno.2所示。进一步，所述连接区的长度和氨基酸的组成没有特别限制，只要其能使抗体重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变即可。通常，连接区不影响或不显著影响重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象；或者，连接区构成了重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)之间的柔性连接而有利于它们的正常折叠。本发明的连接区的序列可以选自：经典的(g4s)3的15个氨基酸的linker、18个氨基酸的linker、7个氨基酸的短linker。有研究表明，单链t细胞受体(stcr)的scfv构建时采用较长的linker可以克服mhc的限制，带有融合蛋白的scfv也适合使用23，25或29个氨基酸长linker。目前，在免疫球蛋白超家族scfv设计时，是否有标准的linker尚无定论。本发明的具体实施方案中选用的linker为噬菌体展示载体中的linker序列，该连接序列较短，其有效性和活性在噬菌体展示技术中得到了充分的验证，也为现阶段表达scfv抗体常用的连接区。在本发明的具体实施方案中，所述连接区的编码序列如seqidno.3所示。所述连接区序列如seqidno.17所示。进一步，所述终止子可以选自：常用的bgh-poly(a)，该终止序列在大多数真核表达载体中适用。本发明的bgh-poly(a)选自invitrogen公司的pcdnatm5/frt载体，该载体是目前最常用的真核表达载体。在本发明的具体实施方案中，所述终止子序列是bgh-poly(a)，序列如seqidno.4所示。进一步，本发明的抗体线性表达框还可以包括有利于抗体检测的标签序列，标签序列包括但不限于c-myc标签、6xhis标签，ha标签，flag标签。在本发明的具体实施方案中，使用了c-myc标签和6xhis标签，所述标签序列连接于抗体轻链可变区编码序列与bgh-poly(a)序列之间。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括前面所述的抗体线性表达框。所述表达载体的构建方法：将本发明的抗体线性表达框可操作地连于载体上。所述载体包括本领域技术人员熟知的在哺乳细胞中用的载体，在原核细胞中的载体，在昆虫细胞中的杆状病毒载体和在酵母细胞中的载体。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞被转染了前面所述的抗体线性表达框或前面所述的表达载体。所述宿主细胞可以分泌表达抗体。适用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho,cos,293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是293细胞。将dna序列高效地转染入宿主细胞中所用方法包括但不限于：脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法等。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的抗体线性表达框，或包含前面所述的表达载体。可以将本发明的药物组合物导入体外培养的细胞或者活体动物体内特定细胞中使之表达相应抗体，发挥基因治疗的目的。活体动物可以是哺乳动物、胎盘哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪类(例如猪)、羊类(例如羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴子或者猿)、猴类(例如绒猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或者人类。进一步，所述药物组合物还包含一种或多种对本领域技术人员而言为公知的其它药学上可接受的成分，该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、缓冲剂、稳定剂。适当的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学书籍中找到。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种制备前面所述的抗体线性表达框的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建翻译启动子与抗体信号肽编码序列的连接序列；(2)构建抗体重链可变区编码序列、连接区编码序列、抗体轻链可变区编码序列依次连接形成的scfv编码序列；(3)将步骤(1)获得的序列与步骤(2)获得的序列连接；(4)将步骤(3)获得的序列与终止子连接。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种抗体的制备方法，所述方法包括前面所述的抗体线性表达框的表达。进一步，所述方法包括如下步骤：(1)培养宿主细胞；(2)按照以上步骤构建前面所述的抗体线性表达框；(3)将抗体线性表达框导入宿主细胞以表达抗体。该方法中使用的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho，cos，293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。本发明所构建的抗体基因线性表达框包含了表达功能性抗体所必需的所有重要原件，包括启动子、抗体信号肽编码序列、抗体重链可变区和轻链可变区的编码序列、终止子序列，因此本发明所建立的抗体表达方法不仅适用于表达人源单克隆抗体，还可用来表达鼠源、马源、猴源等非人源单克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”指的是单链抗体(singlechainfv，scfv)是由免疫球蛋白的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。scfv是目前报导最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区fv段组成。scfv由重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过连接区(linker)连接而成。所加的linker很重要，必须不影响scfv的构象。如本文所用，术语“连接区”(linker)，又可称为连接肽，指的是位于抗体的重链可变区(或其变异体)与抗体的轻可变区(或其变异体)之间的、起连接作用的短肽，其能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变。通常，连接肽不影响或不显著影响重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象；或者，连接肽构成了重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)之间的柔性连接而有利于它们的正常折叠。如本文所用，术语“包括(comprise)”是包括其他组件、元件、整体、步骤等。本发明的有益效果和优点包括：(1)本发明抗体表达方法使抗体的表达跳过了传统的构建表达载体的步骤，从pcr产物直接转染表达宿主，省去了构建抗体表达质粒的酶切、链接、转化、挑单菌落、细菌培养和质粒提取的过程。一方面将抗体表达周期缩短到3天以内，另一方面可以进行高通量筛选。(2)本发明通过选择抗体的重链和轻链可变区构建到抗体线性表达框中，将抗体分子中与抗体结合活性无关的恒定区去除，有利于overlappingpcr过程中与其他元件连接。另外，表达出的scfv中抗体的轻、重链比例为1：1，避免了在转染过程中轻重链比例不恰当对表达效果的影响。(3)简化了表达框的构建。只需构建一个表达框就可以实现抗体的表达。(4)本发明是快速少量的表达抗体，适用于对大量目的抗体的初步功能鉴定。例如噬菌体抗体文库筛选后的大量抗体克隆，流式分选单个b细胞后对大量b细胞内抗体基因的表达和筛选。(5)本系统的构建需要的条件简单，消耗的试剂耗材量少，易于大规模操作和工业化生产。附图说明图1显示本发明的抗体线性表达框的结构示意图；图2显示pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3显示利用westernbolt检测scfv表达的电泳图；图4显示利用elisa检测scfv的抗原结合活性的统计图；图5显示利用ifa检测scfv与抗原结合情况的免疫荧光图，其中a：scfv与vp1蛋白结合；b：阳性对照与vp1蛋白结合；c：scfv与不表达vp1蛋白的正常细胞结合；图6显示pcmx2.51载体结构图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1抗体线性表达框的构建一、表达元件的选择首先选择已经验证过的一株人源抗ev71病毒抗体作为目标抗体，通过选择不同的表达元件(见表1)进行巢式pcr，将各个表达元件依次连接，最终形成一个完整的线性表达框(图1)。表1线性表达框中的表达元件组成元件名称简写来源核苷酸序列翻译启动子pcmvpcmx2.51seqidno.1抗体信号肽编码序列ig-leadimgtseqidno.2重链可变区编码序列ervh抗ev71人源抗体seqidno.5轻链可变区编码序列vk抗ev71人源抗体seqidno.6连接区编码序列linker(g4s)3seqidno.3终止子bgh-ppcdna5-frtseqidno.4二、扩增表达元件的引物设计表2引物设计三、构建步骤1、扩增pcmv-igleader元件依据pcmx2.51载体(图6所示)中元件序列设计cmvigl-f(seqidno.7)和cmvigl-r(seqidno.8)引物，以pcmx2.51载体质粒为模板，pcr扩增pcmv和igleader连接在一起的pcmv-igleader元件，序列如seqidno.13所示。extaq试剂盒购自takara公司，货号为rr001a。pcr反应体系如表3所示。表3pcr反应体系成分体积(μl)质粒模板0.210×exbuffer5dntp4cmvigl-f(10pmol)2cmvigl-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3pcr反应条件如表4所示。表4反应条件反应结束后，pcr产物过2％琼脂糖凝胶，回收800bp左右的条带，即为pcmv-igleader元件，保存备用。2、扩增scfv表达元件申请人之前已将命名为70d1的抗ev71的人源抗体克隆到pcmx2.51载体中，具体步骤如下：抗ev71抗体的vh基因(seqidno.5)通过ncoⅰ和bsmbⅰ双酶切位点克隆入pcmx2.51载体，轻链的vl基因(seqidno.6)则通过miuⅰ和notⅰ克隆入pcmx2.51载体。重组质粒经测序筛选出正确的克隆株，制备质粒供后续使用。pcmx2.51载体带有vh与vl的linker的编码序列，lineker序列为gsasapkleegefsearv(seqidno.17)。设计iglvh-f(seqidno.9)和vl-bgh-r(seqidno.10)引物，扩增scfv片段，序列为seqidno.14，长度为879bp。pcr反应体系如表5所示。表5反应体系成分体积模板(μl)0.210×exbuffer5dntp4iglvh-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2(10pemxotl)aq0.5h2o36.3pcr反应条件如表6所示。表6反应条件反应结束后，pcr产物过2％琼脂糖凝胶，回收900bp左右的条带，即为scfv表达元件(vh-linker-vl)，保存备用。3、扩增bgh-polya元件bgh-polya来源于pcdnatm5/frtvector，该载体购自invitrogen公司，货号为：v6010-20。以pcdn5-frt为模板，设计bgh-f(seqidno.11)和bgh-r引物(seqidno.12)，扩增225bp的bgh-polya元件，序列如seqidno.4所示。pcr反应体系如表7所示。表7反应体系成分体积(μl)模板0.210×exbuffer5dntp4iglvh-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3pcr反应条件如表8所示。表8反应条件反应结束后，pcr产物过2％琼脂糖凝胶，回收200bp左右的条带，即为bgh-polya元件，保存备用。三、overlapingpcr分步连接1、pcmv-igleader与scfv连接形成pcmv-l-scfv以上述回收的pcmv-igleader元件和scfv元件为模板，用cmvigl-f为上游引物，vl-bgh-r为下游引物，用overlapingpcr将上述两个元件连接成一个1662bp的元件，命名为pcmv-l-scfv，序列如seqidno.15所示。pcr反应体系和反应条件如表9和表10所示。表9反应体系成分体积(μl)模板0.210×exbuffer5dntp4cmvigl-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3表10反应条件反应结束后，pcr产物过1％琼脂糖凝胶，回收1600bp左右的条带，即为pcmv-l-scfv元件，保存备用。2、pcmv-l-scfv与bgh-polya融合成完整的表达元件，命名为pcmv-l-scfv-bgh-polya以回收纯化的pcmv-l-scfv元件和bgh-polya元件为模板，以cmvigl-f和bgh-r为引物，扩增整个表达元件，总长度为1887bp，序列如seqidno.16所示。pcr反应体系和反应条件如表11和表12所示。表11反应条件成分体积(μl)模板0.2+0.210×exbuffer5dntp4primer-f(10pmol2primer)-r(10pmol2e)xtaq0.5h2o36.1表12反应条件反应结束后，一部分pcr产物过1％琼脂糖凝胶，回收1800bp左右的条带，即为pcm-l-scfv-bgh-polya。一部分pcr产物用乙醇沉淀后溶于depc水中，用nanodrop测定浓度用于转染293t细胞。四、结果反应结束后，上述pcr产物过1％琼脂糖凝胶的结果如图2所示，图2中m代表marker、1代表pcmv-igleader，2代表scfv，3代表bgh-polya，4代表pcmv-l-scfv，5代表pcmv-l-scfv-bgh-polya。实施例2抗体线性表达框表达抗体1、瞬时转染293t细胞复苏293t细胞，用dmem+10％fbs培养基将293t细胞传2-3代后，将细胞转移到96孔板中继续培养。待细胞密度达70％-90％的时候，用pei将实施例1构建的线性表达框瞬时转染至293t细胞中。将线性表达框中的scfv元件克隆到真核表达载体pcdna3.0(pcdna3.0-scfv)上作为阳性对照转染293t细胞。将转染真核表达载体pcdna3.0作为阴性对照转染293t细胞。具体操作步骤如下：将50ng纯化的线性表达框或100ng的真核表达质粒加入20μl的opti-mem中，轻轻混匀后再加入1μl0.5g/l的pei，再次混匀后室温静置5min。之前将96孔板中细胞培养液弃去，将转染复合物加入细胞中，37℃孵育4h后，每孔再加入200μl细胞培养基，37℃5％co2培养72h后取细胞上清进行抗体活性检测。2、检测scfv抗体表达收集表达上清，加入5×loadingbuffer，100℃煮5min，然后进行sds-page，电泳结束后凝胶中的蛋白样品经iblot干转系统转印至pvdf膜中，5％脱脂牛奶封闭2h，加入1:1000稀释的hrp标记的抗6×his抗体，37℃孵育2h，pbst洗3次后用dab显色。结果如图3所示，观察到有一约40kd的明显条带(箭头所指的条件)，即为表达后的scfv片段，图3中m代表蛋白marker，1代表scfv表达上清，2代表阴性对照。3、scfv抗体活性检测本发明分别用elisa法和间接免疫荧光(ifa)分别检测scfv的活性，该scfv是针对ev71病毒vp1蛋白的。在此之前发明人已经分别表达纯化了ev71病毒原核表达的vp1蛋白(参见文献：张黎，包林，金秋，etal.肠道病毒71型重组vp1蛋白的原核表达及初步鉴定[j].prokaryoticexpressionandpreliminarycharacterizationofrecombinantenterovirus71vp1protein,2):15-8)，并同时构建了在sf9昆虫细胞中表达的杆状病毒表达系统(参见文献：孙丽娜，张黎，张福顺，etal.人源抗ev71病毒基因工程抗体的研究[j].generationofrecombinanthumanantibodiesforev71virus,3):161-3)。(1)elisa将纯化的vp1蛋白按200ng/孔的量4℃过夜包被elisa板，次日取出后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后加入细胞表达上清，细胞表达上清从1:100倍开始倍比稀释。稀释完成以后放于37℃1h，然后洗板机洗涤，加入1:3000的hrp标记的抗人his抗体，37℃孵育1h，再次取出洗涤后用tmb显色液显色，读取od450nm的吸光度值。结果：如图4所示，本发明线性表达框表达出的scfv抗体比含有scfv的真核表达载体表达出的scfv抗体对vp1蛋白的抗原结合活性更强。图4中pc代表阳性对照，nc代表阴性对照。(2)间接免疫荧光(ifa)ifa检测scfv抗体与真核表达的ev71vp1蛋白的结合。构建含有vp1基因的重组杆状病毒质粒，该质粒与线性化的杆状病毒同源重组成有感染性的环形杆状病毒，重组杆状病毒即可感染正常的sf9细胞，具体操作见baculovirusexpressionvectorsystem手册(bdbioseiencespharmingen，usa)。重组杆状病毒在sf9细胞中连续传代增加毒力，选取毒力强的代数感染正常的sf9细胞，72h后收集细胞悬液，洗涤以后用丙酮固定于载玻片上。将scfv的表达上清原液滴加于载玻片上，37℃孵育30min，洗涤5min后，加入用伊文斯蓝稀释的fitc标记的抗his抗体，37℃孵育30min，再洗涤5min后，置于荧光显微镜下观察绿色荧光。用pcdna3.0载体表达的scfv抗体作为阳性对照，用线性框表达的scfv与不表达vp1蛋白的正常细胞反应作为阴性对照。结果：如图5所示，线性表达框表达的scfv抗体能够与sf9表达的vp1蛋白结合，在荧光显微镜下呈现特异性的绿色荧光。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>江苏省疾病预防控制中心<120>一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>616<212>dna<213>巨细胞病毒<400>1acattgattattgagtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa120cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac180tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca240agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg300gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacggtta360gtcatcgctattaccatagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg420tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg480caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg540ggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctttctggctaactagagaa600cccactgcttactggc616<210>2<211>167<212>dna<213>人源<400>2acgtggaaattaattaaacgccgccaacatgggatggagctgtatcatcctcttcttggt60agcaacagctacaggtaaggggttaacagtagcaggcttgaggtctggacatatatatgg120gtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggcgcgcactcc167<210>3<211>54<212>dna<213>人源<400>3gggagtgcatccgccccaaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgta54<210>4<211>225<212>dna<213>牛<400>4ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccc60tggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc120tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt180gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg225<210>5<211>363<212>dna<213>人源<400>5caggtgcagctgcaggagtcggggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctgggttcaccttcagtagctatgctatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactac180gcagactccgtgaagggccgatttaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagatccgga300ttacgatttttggagtggtcacctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcc360tca363<210>6<211>333<212>dna<213>人源<400>6cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatc60tcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcag120cttccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtc180cctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctc240cggtccgaggatgaggctaaatattactgtgcagcatgggatgacaggatggctggtatt300gtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctc333<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7acattgattattgagtagttatt23<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8ggagtgcgcgcctgtggagagaaag25<210>9<211>51<212>dna<213>人工序列<400>9gcctttctctccacaggcgcgcactcccaggtgcagctgcaggagtcgggg51<210>10<211>43<212>dna<213>人工序列<400>10ggctggcaactagaaggcacagctatgcggccccattcagatc43<210>11<211>49<212>dna<213>人工序列<400>11atggggccgcatagctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgc49<210>12<211>33<212>dna<213>人工序列<400>12ccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgc33<210>13<211>783<212>dna<213>人工序列<400>13acattgattattgagtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa120cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac180tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca240agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg300gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacggtta360gtcatcgctattaccatagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg420tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg480caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg540ggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctttctggctaactagagaa600cccactgcttactggcacgtggaaattaattaaacgccgccaacatgggatggagctgta660tcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtaaggggttaacagtagcaggcttgaggt720ctggacatatatatgggtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggcgcgcac780tcc783<210>14<211>879<212>dna<213>人工序列<400>14caggtgcagctgcaggagtcggggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctgggttcaccttcagtagctatgctatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactac180gcagactccgtgaagggccgatttaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagatccgga300ttacgatttttggagtggtcacctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcc360tcagggagtgcatccgccccaaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgtacag420tctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcc480tgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcagctt540ccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtccct600gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccgg660tccgaggatgaggctaaatattactgtgcagcatgggatgacaggatggctggtattgtg720ttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcggtcagcccaaggctgccccctcggtcact780ctgttcccaccgtcctctgcggccgcacatcatcatcaccatcacggggccgcagaacaa840aaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcatag879<210>15<211>1662<212>dna<213>人工序列<400>15acattgattattgagtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa120cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac180tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca240agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg300gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacggtta360gtcatcgctattaccatagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg420tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg480caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg540ggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctttctggctaactaga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