用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)作为一种机会性致病菌，是食物中毒的主要原因之一，能够引起以恶心、呕吐、腹痛及腹泻为主要特征的临床症状。该菌广泛分布于土壤、污水和空气中，在各类生或熟的动植物食品中也常见。蜡样芽孢杆菌具有代谢通路多样化的特点，在不同的环境中具备生态学适应性及强大的生存能力，可以抵抗不利因素，更好地传播。食品由于加工不规范或存放不当极易污染蜡样芽孢杆菌，污染的蜡样芽孢杆菌或残存的芽孢生长繁殖后，因污染的食物外观及性状无明显变化而被误食，从而导致食物中毒。蜡样芽孢杆菌中毒的发病率较高，可达60-100％。因此，建立简便、快速的检测蜡样芽孢杆菌的方法成为研究该菌检测方法的热点。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification,rpa)是2006年首次报道的核酸扩增技术，因其操作简单、反应快速的特点，在医疗诊断、食源性致病菌、转基因食品和动物疫病检测中受到广泛关注。rpa技术主要依赖于重组酶、单链结合蛋白和具有链置换活性的dna聚合酶在恒温条件下(25-42℃)进行，而real-timerpa技术将rpa基础反应与荧光探针结合，具备了实时监测扩增进程的优势，灵敏度和特异性也进一步提高，已被广泛运用于细菌、病毒及寄生虫的检测。

目前已报道的蜡样芽孢杆菌检测方法有分离培养法、普通pcr、多重pcr、荧光pcr、lamp及基因芯片等，但是分离培养法和基因芯片技术操作繁琐，检测时间相对较长；pcr技术不仅对环境要求高，而且需要昂贵的pcr仪器和熟练的技术人员。上述方法在突发食物中毒等公共卫生事件中的应用存在有诸多不便。lamp方法属于等温检测方法，但lamp反应温度较高，高于60℃，而且反应时间较长，一般在30-60min之间。

技术实现要素：

针对现有蜡样芽孢杆菌检测方法操作繁琐、检测时间长，成本高等问题，本发明提供一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒。

进一步地，本发明还提供用于蜡样芽孢杆菌的检测方法及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

本发明发明人通过对于genebank中蜡样芽孢杆菌的16srna基因序列(登录号：ky224970.1)进行分析，选择保守区域，设计实时荧光rpa即real-timerpa引物及exo探针，目的片段大小为297bp。

一种蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光rpa检测蜡样芽孢杆菌，包括基于蜡样芽孢杆菌16srna基因序列的一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgag-3'

下游引物：5'-caacatctcacgacacgagctgacgacaacca-3'

探针：5'-ctaagtgttagagggtttccgccctttagtgc-fam-dt-thf-

aag-bhq1-dt-taacgcattaagc-c3-3'。

进一步地，本发明还提供一种用于蜡样芽孢杆菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光rpa方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、采用上述用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；

步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。

进一步地，本发明还提供所述的检测试剂盒或检测方法在蜡样芽孢杆菌检测检测领域中的应用。

本发明建立的real-timerpa方法与real-timepcr相比，具有操作简便、反应时间短的优点，同时本研究中使用的optigeneiii等温扩增荧光检测系统紧凑小巧，轻便耐用，仅为1.75kg左右，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可实现便携式的致病菌现场快速检测。同lamp方法相比，虽然lamp和real-timerpa均属于等温检测方法，但lamp反应温度较高反应温度较高，高于60℃，而且反应时间较长，一般在30-60min之间，而real-timerpa扩增在常温下(25-42℃)即可实现，且具有良好的特异性，对基因组dna的检测灵敏度可达1.0×10^-3ng/μl，操作简单，在20min内即可完成，为蜡样芽孢杆菌快速检测技术领域提供了有价值的参考方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的real-timerpa灵敏性试验结果示意图；

图2是本发明对比例提供的real-timepcr灵敏性试验结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光rpa检测蜡样芽孢杆菌，包括基于蜡样芽孢杆菌16srna基因序列的一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgag-3'

下游引物：5'-caacatctcacgacacgagctgacgacaacca-3'

探针：5'-ctaagtgttagagggtttccgccctttagtgc-fam-dt-thf-

aag-bhq1-dt-taacgcattaagc-c3-3'。

优选地，所述检测试剂盒还包括冻干酶制剂和醋酸镁溶液。

优选地，所述检测试剂盒的反应体系组成如下：2μl的10μm的上游引物，2μl的10μm的下游引物，0.6μl的10μm的探针，12.5μl的体积浓度为20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。

优选地，所述冻干酶制剂包括1mm的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的单链结合蛋白，120ng/μl的reca重组酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20％的聚乙二醇，5mm的二硫苏糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

本发明还提供一种用于蜡样芽孢杆菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光rpa方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、采用上述用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；

步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。

优选地，扩增反应在温度设定为39℃的等温扩增荧光检测仪中进行，反应时间为20min。

优选地，所述蜡样芽孢杆菌的上、下游引物的终浓度均为0.4μm，探针的终浓度为0.12μm。

优选地，所述蜡样芽孢杆菌的dna的提取包括以下步骤：将将蜡样芽孢杆菌纯培养菌接种于8-12ml营养肉汤中，在35-37℃下培养14-17h；然后取1ml菌液以10000rpm转速离心1min，弃上清液；将菌体沉淀按照细菌dna提取试剂盒方法提取细菌基因组dna，提取完毕后立即使用或-20℃保存备用。

优选地，使用超微量分光光度计测定所提取的细菌基因组dna的核酸浓度。

本发明还提供所述的检测试剂盒或检测方法在蜡样芽孢杆菌检测检测领域中的应用。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

本实施例提供用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒以及检测方法，所用的主要试剂与设备有：甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(myp)、营养肉汤，购自北京陆桥技术有限责任公司；细菌基因组dna提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；premixextaq，购自宝生物工程(大连)有限公司；raa试剂盒(荧光型)购自浙江泰晶生物科技有限公司；引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

genieiii等温扩增荧光检测系统，英国optigene公司；abi7500实时荧光pcr仪，美国abi公司；nanodrop2000c超微量分光光度计，美国thermoscientific公司。

实施例1蜡样芽孢杆菌的检测方法-实时荧光rpa方法的建立

1、引物及探针序列的设计及制备

本发明发明人通过对于genebank中蜡样芽孢杆菌的16srna基因序列(登录号：ky224970.1)进行分析，选择保守区域，设计实时荧光rpa即real-timerpa引物及exo探针，目的片段大小为297bp。

本发明设计合成了一对引物和一条探针，如表1所示。

表1本发明设计的蜡样芽孢杆菌real-timerpa引物和探针

2、蜡样芽孢杆菌菌株及细菌基因组dna的提取

本研究使用的蜡样芽孢杆菌均由本实验室保存。

将蜡样芽孢杆菌(cicc63301)纯培养菌接种于10ml营养肉汤中，在37℃下培养16h；取1ml菌液以10000rpm的转速离心1min，弃上清液；将菌体沉淀按照细菌dna提取试剂盒方法提取细菌基因组dna，立即使用或-20℃保存备用，同时使用nanodrop2000c超微量分光光度计测定所提取的蜡样芽孢杆菌dna的核酸浓度。

3、蜡样芽孢杆菌检测试剂盒的制备

使用raa试剂盒(荧光型)配制单个反应体系，反应体系中如下：2μl的10μm的上游引物(终浓度为0.4μm)，2μl的10μm的下游引物(终浓度为0.4μm)，0.6μl的10μm的探针(终浓度为0.12μm)，12.5μl的体积浓度为20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。将上述将47.5μl体系混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，然后向反应管中加入2.5μl的280mm的醋酸镁，瞬时离心并涡旋后放入等温扩增荧光检测仪genieiii中，温度设定为39℃，反应时间为20min。

所述冻干酶制剂包括1mm的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的单链结合蛋白，120ng/μl的reca重组酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20％的聚乙二醇，5mm的二硫苏糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

4、蜡样芽孢杆菌检测方法-real-timerpa方法的建立

所述检测方法的建立包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中反应液采取上述的蜡样芽孢杆菌的上、下游引物及探针，将所述反应液混匀，加入到装有冻干酶制剂的反应管中，溶解，再向反应管中加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，进行扩增反应；

扩增反应在温度设定为37-39℃的等温扩增荧光检测仪中进行，反应时间为20-30min；

步骤4、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。

为了更好的说明本发明实施例提供的用于蜡样芽孢杆菌检测的实时荧光rpa方法的建立，下面将实施例1建立的real-timerpa方法做特异性性试验。

为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。

对比例1用于蜡样芽孢杆菌检测方法-real-timepcr方法的建立

1、real-timepcr的一对引物和探针如表2所示.

表2本发明设计的蜡样芽孢杆菌real-timepcr引物和探针

2、real-timepcr方法的建立

反应体系为：1.5μl的10μm的上游引物(终浓度为0.6μm)，2μl的10μm的下游引物(终浓度为0.6μm)，1μl的5μm的探针(终浓度为0.2μm)，12.5μl的premixextaq，1μl的病毒dna模板，7.5μl的ddh2o。

将上述体系充分混匀后放入abi7500实时荧光pcr仪中，反应程序设置为：95℃，预变性30s；95℃变性5s，60℃延伸35s，35个循环，60℃收集荧光信号。

为了更好的说明本发明实施例提供的用于蜡样芽孢杆菌检测的实时荧光rpa方法的应用，下面将实施例1与对比例1分别作特异性、灵敏性试验以及人工污染样品检测的试验。

特异性试验

以表3中所示菌株的基因组dna作为模板进行real-timerpa反应，确定是否出现特异性扩增曲线。

表3

注：+，阳性结果；－，阴性结果。

由表3结果可知，对蜡样芽孢杆菌和其他细菌基因组dna作为模板进行real-timerpa检测，结果表明仅蜡样芽孢杆菌呈现典型的扩增曲线，为阳性结果，而其他芽孢杆菌和非芽孢杆菌细菌均未出现扩增曲线，结果说明该方法具有良好的特异性。

灵敏性试验

将浓度为100ng/μl的蜡样芽孢杆菌基因组dna使用ddh2o进行10倍梯度稀释，连续稀释8个梯度后，以不同稀释度的dna作为模板进行real-timerpa和real-timepcr检测，结果如1和图2所示。

图1为real-timerpa检测结果，图2为real-timepcr检测结果。图1、2中1:1.0×10²ng/μl；2:1.0×10¹ng/μl；3:1.0×10⁰ng/μl；4:1.0×10^-1ng/μl；5:1.0×10^-2ng/μl；6:1.0×10^-3ng/μl；7:1.0×10^-4ng/μl；8:1.0×10^-5ng/μl。

从图1、2的检测结果表明，real-timerpa的检测限为1.0×10^-3ng/μl，同real-timepcr方法检测限一致。

人工污染样品检测的试验

将蜡样芽胞杆菌(cicc63301)经过夜纯培养后，用生理盐水进行10倍梯度稀释，选取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度的菌液200μl涂于myp琼脂平板上，并作3个平行样品，用于计算纯培养菌的初始浓度。将不同稀释度的菌液1ml分别添加到25g大米饭样品中(样品预先按照gb4789.14-2014检测，未检出蜡样芽胞杆菌)，再添加到225mlpbs中，用拍击式均质器连续均质1-2min，从中各取1ml菌液参照本发明提供的细菌基因组dna的提取方法进行细菌dna的提取，取1μl作为模板进行real-timerpa和real-timepcr检测，检测结果如表4所示。

表4人工污染样品检测的试验检测结果

注：－，未检出。

由表4可以看出，当污染量≥1.5×10⁴cfu/g时，real-timerpa即可检出大米饭中蜡样芽孢杆菌，所需要时间仅为6-13min；当污染量≥1.5×10⁵cfu/g，real-timepcr方可检出大米饭中蜡样芽孢杆菌，所需时间在30min以上(ct值为20-31)。结果说明，在检测人工污染样品时real-timerpa的检测时间明显低于real-timepcr的检测时间，real-timerpa的灵敏性高于real-timepcr。

米饭等粮食加工品是蜡样芽孢杆菌食物中毒最主要的食品种类。本发明中建立的real-timerpa方法能有效的检测出米饭中污染的蜡样芽孢杆菌，且检测灵敏度优于real-timepcr，反应时间也明显少于real-timepcr。该方法的成功建立，结合细菌核酸的快速提取，可以达到现场快速检测的目的，为食品加工质量控制及食源性疫病等公共卫生事件中蜡样芽孢杆菌的检测提供了可借鉴的技术手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgag32

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

caacatctcacgacacgagctgacgacaacca32

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctaagtgttagagggtttccgccctttagtgcaagtaacgcattaagc48

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcggcgtgcctaatacatgc20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctcaggtcggctacgcatcg20

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tcgagcgaatggattaagagcttgc25