一种抗CD24人源化抗体融合蛋白的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可同时与白细胞分化抗原cd24(clusterofdifferentiation24)和nkg2d受体特异性结合的cd24人源化抗体融合蛋白hg7-mica，其利用hg7的靶向性将mica特异性地展示于肿瘤细胞表面，增强nk细胞对人乳腺癌细胞的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(adcc)，避免了由于细胞表面mica分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸。hg7-mica的设计开辟了一种新的肿瘤免疫治疗策略，是一种特异性重塑nk细胞对cd24+肿瘤细胞免疫监视功能的双功能抗体融合蛋白。

背景技术：

当今全球恶性肿瘤发病率及死亡率一直呈上升趋势。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞表面标记物脱落导致其逃脱免疫监视，这也是放化疗法常产生耐药和低安全性评价的瓶颈所在。因此，寻找特异性的分子靶标与新颖的临床用药手段是肿瘤个性化治疗的关键。肿瘤免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，利用“生物导弹”将机体中天然存在的免疫细胞这种弹药特异性地募集至肿瘤病灶部位，该策略具有高特异性与低副作用的优势。

肿瘤相关性抗原mica

mica(mica，majorhistocompatibilitycomplexclassichain-relatedgenea)是一种高度糖基化的蛋白质分子，属于非经典hla-i(humanleucocyteantigen-i)类基因家族。mica广泛且特异性地表达于上皮来源的原发性肿瘤细胞中，是一种公认的肿瘤相关性抗原。nk细胞或cd8⁺t细胞借表面受体nkg2d与配体mica/b的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解。虽然证实mica分子表达于多种肿瘤细胞表面，但mica的脱落导致肿瘤细胞虽然仍属于mica阳性，但却能避开免疫监视并导致免疫逃逸。因此寻找一种新的展示方式以重塑mica在肿瘤免疫监视中的作用成为肿瘤免疫治疗策略的关键，抗体是激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规靶向药物，其中单链抗体由于其分子量小更容易通过血脑屏障到达病灶部位而更多地用于此类靶向设计。由此我们提出一种假设：将mica分子与抗体融合，借助于靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体对肿瘤细胞的识别和结合，mica被锚定于肿瘤细胞表面；进一步通过mica与nkg2d的结合刺激nk细胞杀伤肿瘤细胞，重建由nkg2d途径激活机体自身的免疫监视作用。

nkg2d分子是c型凝集素样受体家族的一种同源二聚体ii型跨膜蛋白。在肿瘤的生长进程中，mica等配体下调或蛋白水解脱落会抑制nk细胞介导的免疫调控，而诱导nkg2d的配体在肿瘤细胞表面的表达会使肿瘤细胞更容易被nk细胞识别和杀伤。nkg2d通路活化效应细胞的分子机制：nkg2d与其配体结合，辅以接头蛋白分子dap10或dap12的帮助，激活下游信号通路，最终活化nk细胞。

肿瘤标志物cd24分子

经文献调研发现白细胞分化抗原cd24(clusterofdifferentiation24)作为一种潜在的致癌因子，在结直肠癌、乳腺癌、肝癌、小细胞肺癌等多种肿瘤组织中过表达，而在正常组织中不表达或低表达。基于cd24分子肿瘤细胞标记物的特点，我们提出cd24抗体作为有效的载体连接mica分子，激活nkg2d途径，重塑nk细胞的免疫监视作用。科学家致力于该类型靶点设计抗体融合蛋白，这些肿瘤表面抗原都具有与cd24相同的特点：1.肿瘤细胞表面高表达；2.正常组织细胞表面不表达或低水平表达。

免疫细胞天然配体和抗体的融合蛋白

目前已经有很多针对抗体融合蛋白的开发，其设计方式为：1.利用靶向cd138、cea的单链抗体连接nkg2d配体效应分子制备“生物导弹”，有效募集nk细胞至肿瘤病灶部位，杀伤肿瘤细胞；2.利用cd20单链抗体连接mica设计抗体融合蛋白，以有效治疗淋巴瘤；3.采用化学偶联的方式将靶向cd20单抗的fab片段与mica相连，有效增强nk细胞对cd20阳性肿瘤细胞的识别与杀伤作用。至今鲜有nkg2d配体mica分子相关融合蛋白的报道。

通过自主研发的cd24人源化抗体与mica分子相连接，构建成融合蛋白，可以显著加强nk细胞得免疫监视作用。nk细胞在肿瘤免疫监视中起到关键性作用，nk细胞的激活取决于其表面的nkg2d等活化性受体。阳性表达cd107a分子是具有杀伤活性nk细胞的标记物。nk细胞主要的活化性受体包括nkg2d、fcγriiia和天然细胞毒受体(ncrs)，免疫配体募集并激活nk细胞的效应功能，活化后的nk细胞通过释放穿孔素和颗粒酶，同时分泌细胞因子ifn-γ和tnf-α来调节效应细胞功能。因此，nk细胞在特异性杀伤肿瘤细胞的新型治疗手段中成为了一个很有前景的武器。

基于上述理论基础与科研实践，本发明将已具有自主知识产权的抗cd24人源化抗体hg7与mica通过柔性肽连接，设计一种新型重组蛋白hg7-mica。hg7-mica的设计开辟了一种新的肿瘤免疫治疗策略。该研究一方面重塑nkg2d途径诱导的nk细胞免疫监视，通过激活机体自身免疫功能有效杀伤肿瘤；另一方面该治疗方案发挥靶向性优势，有效降低化放疗药物产生的毒副作用，在临床前研究与临床安全性评价中将会占据制高点。因此，具有自主知识产权的融合蛋白hg7-mica的开发，为肿瘤免疫治疗体系提供新颖的临床用药方案。

技术实现要素：

发明目的

本发明提供一种具有抗肿瘤免疫疗效的cd24抗体融合蛋白hg7-mica。本发明抗体融合蛋白的特征为g4s柔性肽linker连接cd24人源化抗体hg7与mica分子，保留了二者原有的亲本活性；哺乳动物细胞表达系统进行蛋白表达，保证融合蛋白的生物活性；利用hg7的靶向性将mica特异性地展示于cd24⁺肝癌细胞huh-7表面，避免了由于细胞表面mica分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸；激活nk细胞并诱导其分泌ifn-γ、tnf-α等细胞因子，重塑nk细胞对肿瘤细胞的免疫监视功能；体内外抑制肝癌细胞huh-7的生长。

技术方案

一种cd24抗体融合蛋白，该融合蛋白以自主研发的序列全新的抗cd24人源化抗体hg7与人源mica分子为基础，运用基因重组等手段，构建成双功能抗体融合蛋白hg7-mica。

其中一条链由人源化抗体hg7重链和mica蛋白组成，其氨基酸序列表为seqno.1；另一条链为hg7轻链，其氨基酸序列表为seqno.2。

一种哺乳动物细胞cho-s分泌表达法，用于分泌表达cd24抗体融合蛋白hg7-mica。

一种表达载体，含有cd24抗体融合蛋白hg7-mica目的基因的核酸分子。

一种重组宿主细胞，含有上述的表达载体。

cd24抗体融合蛋白hg7-mica的应用方式：hg7人源化抗体发挥靶向性作用将mica分子特异性地展示于cd24高表达的肿瘤细胞表面，通过mica半分子选择性地与nk细胞表面的nkg2d受体结合，提高机体微环境中nk细胞的靶向识别能力与杀伤作用。

cd24抗体融合蛋白hg7-mica在治疗肿瘤药物中的应用。

发明进一步说明：

本发明中靶向cd24的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由全长抗体和mica蛋白通过柔性肽(ggggs)连接，另一条是全长抗体的轻链。

本发明的一个目的是构建cd24抗体融合蛋白hg7-mica的表达载体，筛选该抗体融合蛋白高表达的工程细胞株，提供一种可以稳定高表达和批量纯化上述cd24抗体融合蛋白hg7-mica的方法；本发明的另一个目的是建立cd24抗体融合蛋白hg7-mica的体内外药效评价体系，评估肿瘤免疫治疗方案的可行性。

本发明利用overlappcr(polymerasechainreaction)技术将本实验室改造获得的cd24人源化抗体与人源mica胞外1-3区基因辅以柔性肽g4s相连接，进行克隆重组，构建抗体融合蛋白hg7-mica重组载体，通过电穿孔法稳定转染cho-s细胞，经两轮g418加压筛选获得正确表达hg7-mica的稳定工程细胞株；使用proteina亲和层析柱分离纯化目的蛋白，sds-page检测纯化产物为电泳纯，westernblot鉴定表达产物表达及装配正确；spr实验分析抗体与抗原的亲和能力。

附图说明

图1是融合蛋白基因重组分析图，重组基因包括重链基因大小为2312bp、轻链基因大小约为764bp。

图2是融合蛋白的结构示意图，该蛋白由两条链组成，其中cd24抗体的ch区和mica蛋白通过柔性肽(ggggs)连接，而重链与轻链及重链是在表达细胞中自行通过二硫键结合组装在一起。

图3是抗体融合蛋白hg7-mica重链基因的构建鉴定图。已获得hg7的基因序列，我们以此为基础构建抗体融合蛋白hg7-mica。在hg7重链h的3’端引入hmica序列，获得新的重链h-mica。“h-mica”是overlappcr反应扩增hg7-mica的重链h-mica目的基因，“h”是pcr反应扩增hg7的重链，“mica”是hmica基因片段。

具体实施方式

实施例1cd24抗体融合蛋白hg7-mica的构建

分别以hg7重轻链基因，mica基因及pcapuro、pmh3质粒为模板，设计并合成引物进行pcr扩增。融合蛋白hg7-mica的构建以hg7重链基因h为基础，再进行重叠pcr延伸扩增获得完整的h-mica基因。pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。pcr扩增终产物及质粒pcapuro、pmh3用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用t4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。