本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种牛跟腱ⅰ型胶原的提取方法。
背景技术：
胶原是脊椎动物体内含量最多的一类蛋白质，也是细胞外基质的四大组分之一。它含有一个或几个由α链组成的三螺旋结构的区域，该独特的三螺旋结构及其分子之间的共价交联，赋予胶原纤维极高的抗拉强度和热稳定性，也是胶原与细胞发挥相互作用的结构基础。
现有的提取方法中，提取的胶原纯度低，如何提取高纯度的具有三螺旋结构的ⅰ型胶原成为了亟待解决的技术难题。硬脑膜/硬脊膜在外伤以及肿瘤侵及时，可能造成不同程度的脑膜/脊膜的损伤与缺损，继而导致脑脊液渗漏，继发感染。目前提取的材料可能会引起排斥反应，且由于局部组织的反应，可造成对脑组织的刺激，形成癜痕或包裹反应、脑膜炎症状或出血等严重并发症，目前的修复材料大都依赖进口，价格昂贵。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛跟腱ⅰ型胶原的提取方法，该方法简单且对设备要求低，制备的产品纯度及得率高。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种牛跟腱ⅰ型胶原的提取方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块，加入碳酸氢钠水溶液浸泡16h，取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
（2）将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
（3）将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
（4）取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入胃蛋白酶,角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
（5）将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
进一步的，所述碳酸氢钠水溶液的质量分数为10%。
进一步的，所述肉豆蔻酸溶液的质量分数为5-8%。
上述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.1-0.15g。
进一步的，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的ph值为3.5。
进一步的，所述胃蛋白酶的加入量占牛跟腱粉末重量的0.6-0.8%。
进一步的，所述角鲨烯的加入量占牛跟腱粉末重量的0.2-0.3%。
进一步的，所述二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1。
本发明创造性的将牛跟腱浸泡于肉豆蔻酸溶液中，通过加入少量的三乙醇胺，能够对牛跟腱的脱脂处理更加彻底，去除绝大部分可溶性酯类等物质，提高后期的提取效率，同时提高产品的纯度。发明人经过大量实验发现，本发明提供的提取方法，能够提高酶解效率，减少酶解的时间，同时，能够提高所得产品的纯度。本发明所采用的盐析透析方法采用现有方法即可。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的制备方法简单，对设备要求低；
（2）本发明所得产品为高纯度的具有三螺旋结构的ⅰ型胶原，不会对神经组织产生机械性损伤，生物相容性好。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面通过具体实施例和临床试验数据对本发明的技术方案进行进一步的阐述。
实施例1
1.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10%的碳酸氢钠水溶液浸泡16h（碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可），取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
1.2将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的质量分数为5%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.15g；
1.3将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
1.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.6%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.2%角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1；
1.5将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
实施例2
2.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10%的碳酸氢钠水溶液浸泡16h（碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可），取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
2.2将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的质量分数为6.5%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.12g；
2.3将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
2.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.8%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1；
2.5将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
实施例3
3.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10%的碳酸氢钠水溶液浸泡16h（碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可），取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
3.2将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的质量分数为8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.1g；
3.3将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
3.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1；
3.5将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
对比例1（纯度不够，影响提取效率）不加三乙醇胺
1.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10%的碳酸氢钠水溶液浸泡16h（碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可），取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
1.2将纯牛跟腱加入到质量分数为8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
1.3将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
1.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1；
1.5将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
对比例2（提取时间长，纯度小）不加角鲨烯
2.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10%的碳酸氢钠水溶液浸泡16h（碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可），取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
2.2将纯牛跟腱加入到质量分数为8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；
2.3将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
2.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；
二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1；
2.5将酶解液盐析透析后，得牛跟腱ⅰ型胶原。
对比例3
3.1将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，用氯化钠溶液浸泡，去除杂质，晾干待用；
3.2将晾干的牛跟腱丙酮浸泡脱脂；然后采用透析袋处理后，利用胃蛋白酶进行提取。
效果实施例
（一）将实施例1-3及对比例1-3提取的胶原蛋白进行提取率及纯度的检测，具体结果见表1。
表1
（二）将本发明实施例提取的胶原应用18克高纯度的具有三螺旋结构的i型医用胶原材料在盐酸的环境下采用28,000转速搅拌15分钟制成2.5%浓度的胶原复合悬浊液。其后使用氢氧化钠调节其酸碱度和100%酒精，使之达到粘稠度符合要求的状态。继续搅拌15分钟。取500毫升倒入50x50厘米的冷冻托盘中，于-75摄氏度的低温条件下，冷冻3～6小时，干燥25小时，制成孔隙小于20微米，2毫米厚的脑膜/脊膜生物膜片。
动物实验：将3只雄性猎狗进行右侧前外侧颅骨切除术。用直径3厘米的环钻行行右前外侧顶骨切开术。不损伤任何颅骨下组织。小心止血后将其下的硬脑膜提起，小心的剪切直径3厘米的硬脑膜。保护其下的蛛网膜和软脑膜不受任何损伤。
将分别采用实施例1-3直径3.5厘米的生物膜片小心的植入硬脑膜缺损的部位，覆盖硬脑膜的缺损部位和脑实质的表面而进行缝合。其后小心止血后将切除的颅骨瓣放回颅骨缺损的部位。
术后动物全部健康成活，无任何神经，精神异常症状，无脑脊液渗漏，无感染。6周后处死动物，用直径6厘米的环钻以第一次手术骨瓣复位后的原颅骨的中心为新中心，扩大范围切除颅骨，暴露其下的硬脑膜和脑实质组织。
肉眼观察：3只实验动物的右前外侧顶骨愈合亮好，无任何感染。掀开骨瓣后，颅骨和硬脑膜间无明显粘连，新生的硬脑膜组织光滑，硬脑膜，蛛网膜和脑实质间无明显粘连和瘢痕。脑实质表面正常，无任何退化性改变。
组织学检查：将颅骨/硬脑膜/脑实质整体切除。经脱钙，腊块包埋后，制成5～6微米厚的切片经he染色后观察组织学形态。
显微镜下常规切片检查均未发现异常组织细胞出现。整体显示为序的成纤维细胞和纤维结碲组织。和正常硬脑膜相比除在新生硬脑膜基底有活动性新生细胞分化外，在结构，形态和正常硬脑膜无异。无粘连，无瘢痕形成。偏光显微镜下显示新生的纤维组织
呈现出i型胶原特有的结构-阶段性光谱结构，而且植入的胶原膜均已降解吸收，无任何残留的胶原材料。
但是对比例3制备的膜片进行重复试验过程中，出现癫痕形成的案例。