一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法与流程

本发明涉及一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法。

背景技术：

尖吻蝮蛇凝血酶(haemocoagulaseacutus，简写为halase)是本团队研发的一类止血新药，是一种从尖吻蝮蛇(agkistrodonacutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，具有较强的止血作用，且安全无毒。

目前，毒蛇的来源主要为人工饲养和野外捕捉两种方式，各异的地理环境和饲养条件等因素，使得蛇毒的成分和性质都存在着很大的差异，为规模化生产造成一定的难度，产品的均一性受到限制。随着生物工程技术的发展，开发蛇毒类凝血酶(snakevenomthrombin-likeenzymes,svtles)重组蛋白产品替代这类天然产物成为了svtles药物研发的一个重要方向，以期通过蛋白质工程的手段，稳定表达具有良好生理活性的svtles产品。

对于svtles重组蛋白表达体系的构建，最早是通过原核表达系统进行的。虽然svtles的糖基化修饰情况不尽相同，但是大部分svtles都是糖蛋白，含量在0％-30％间，个别种类甚至高达40％以上。而常用的细菌表达株并不具备糖基化的能力，这将大大影响到蛋白的活性。而且大肠杆菌的表达多以包涵体形式存在，研究人员通常需要添加硫氧还原蛋白(thioredoxin,trxr)标签来增加外源蛋白的可溶性表达。真核表达系统中，较为成熟的酵母表达体系也被用作svtles的重组蛋白表达。然而酵母表达体系对于外源蛋白的表达可能存在过度的糖基化修饰，或者缺乏复杂性糖链的修饰，这些也会影响重组蛋白的功能。

哺乳动物细胞表达体系因具有更高级的糖基化机制，逐渐成为了异源糖蛋白表达的重要体系。在哺乳动物细胞表达体系中，cho细胞已经成为了生物制药领域最重要的表达系统，无血清悬浮培养技术的发展极大改善了传统哺乳动物细胞表达系统易受病毒感染、自动化水平低的局限性，更加适合工业化大规模生产。所以其应用得到不断拓展，被广泛应用于抗体、疫苗、重组蛋白药物等生物医药制品的研发。美国食品药品监督管理局在2010年批准了cho表达蛋白直接入药。

技术实现要素：

为解决上述技术问题：本申请提出一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法，首次利用cho细胞通过无血清悬浮培养技术表达一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白，包括如下步骤：

(1)优化尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(2)pcr扩增优化的尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(3)构建表达载体；

(4)将重组质粒转染至cho细胞；

(5)重组蛋白表达鉴定。

其中，步骤(3)表达载体的构建方法具体为：将回收的pcr产物与pmcx克隆载体酶切连接，构建agkis-pmcx质粒，将agkis-pmcx质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增，经amp抗性筛选出阳性克隆，进行测序；提取测序正确的重组质粒。

所述pcr产物与pmcx克隆载体酶切连接方法优选方法为：对扩增后的尖吻蝮蛇凝血酶基因进行内切酶消化，使用t4连接酶把基因目的片段连接到表达载体上。

步骤(4)将重组质粒转染至cho细胞的具体方法为：取细胞适量离心,用新鲜溶液重悬，使细胞终密度为5mioc/ml；离心时，将质粒dna与pei预混，室温孵育；处理好的dna&pei混合物，加入到准备的细胞中，混匀，31℃培养；转染，加入适量的dmso，摇晃混匀，31℃培养；转染后取样品进行检测；其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染，含a亚基基因序列和b亚基基因序列的重组质粒共转染至cho细胞。

所述步骤(1)的具体方法包括以下步骤：

1)根据哺乳动物的编码偏好对尖吻蝮蛇凝血酶基因序列进行优化；

2)根据合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因设计上游引物和下游引物，引物中引入了notⅰ和bamhⅰ两个酶切位点，另外还添加了一段分泌性信号肽序列；

3)该基因包含了蛋白质的a亚基和b亚基两个亚基序列，通过对上下游引物的调整，可分别扩增出蛋白质基因序列全长、a亚基基因序列和b亚基基因序列。

相对于现有技术，本发明是首次利用无血清悬浮式培养的cho细胞表达一种重组尖吻蝮蛇凝血酶，运用生物工程手段，较成功地解决了蛇毒产品原料来源不足、质量不稳定的实际生产问题。

附图说明

图1为本发明实施例优化重组尖吻蝮蛇凝血酶基因序列的示意图。

图2为本发明实施例重组尖吻蝮蛇凝血酶sds-page电泳示意图。

图3为本发明实施例重组尖吻蝮蛇凝血酶westernblot的示意图

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。

实施例：尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白表达的操作方法

1.实验材料

1.1实验仪器

pcr仪：bio-rad公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；凝胶成像系统：珠海黑马医学仪器有限公司；切胶仪：杭州米欧仪器有限公司；恒温混匀仪：杭州米欧仪器有限公司；超微量紫外可见分光光度计：美国quawell公司0；2-8度冷藏箱：中科美菱低温科技有限责任公司；-20度医用低温箱：中科美菱低温科技有限责任公司；三孔电热恒温水槽：上海恒一科学仪器有限公司；细菌培养箱：上海恒一科学仪器有限公司；卧式全温振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；细胞培养摇床：adolfkuhner公司；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；磁力搅拌器：wiggens公司；ph计：奥豪斯仪器(上海)有限公司；双人净化工作台：上海苏净实业有限公司；转印系统：bio-rad公司；垂直电泳系统：bio-rad公司；脱色摇床：上海天能科技有限公司；高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.2实验试剂

表达载体pmcx、大肠杆菌dh5α、chodg44细胞均由广州汉腾生物科技有限公司制备、提供。koddna聚合酶：东洋纺(上海)生物科技有限公司；t4dna连接酶：近岸蛋白质科技有限公司；限制性内切酶notⅰ：thermofisherscientific公司；限制性内切酶bamhⅰ：thermofisherscientific公司；质粒提取试剂盒：美国omega公司；dna琼脂糖凝胶回收试剂盒：美国omega公司；dnamarker：thermofisherscientific公司；cho培养液：lonza公司；dmso：天津市化学试剂一厂；pei：sigmaaldrich公司；台盼蓝染液：sigmaaldrich公司；特异性多克隆抗体：cloud-clone公司；兔源igg抗体：proteintech公司；氨苄青霉素：生工生物科技有限公司；琼脂粉：广东环凯生物科技有限公司；酵母浸粉：oxoid公司；蛋白胨：oxoid公司。

2.实验方法

2.1基因扩增

通过jcat(javacodonadaptationtool)把尖吻蝮蛇凝血酶的蛋白质序列翻译成dna序列，并根据哺乳动物的编码偏好对序列进行了优化，优化后的基因序列见下图1，该基因序列由广州艾基生物技术有限公司合成。

根据合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因设计上游引物和下游引物，引物中引入了notⅰ和bamhⅰ两个酶切位点，另外还添加了一段分泌性信号肽序列，见表1。

表1重组尖吻蝮蛇凝血酶的pcr引物

该基因序列包含了蛋白质的两个亚基(a和b)序列，通过对上下游引物的调整，可分别扩增出蛋白质基因序列全长、a亚基基因序列和b亚基基因序列。对合成基因进行pcr扩增，pcr产物用琼脂糖凝胶电泳回收。

对扩增后的尖吻蝮蛇凝血酶基因进行内切酶消化，使用t4连接酶把基因目的片段连接到表达载体上。选用氨苄青霉素(ampicillin,amp)作为筛选抗生素。

2.2表达载体构建

将回收的pcr产物与pmcx克隆载体酶切连接，构建agkis-pmcx质粒。将agkis-pmcx质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增，经amp抗性筛选出阳性克隆，送广州艾基生物技术有限公司测序。提取测序正确的重组质粒，用作后续的cho细胞转染试验。

2.3cho细胞转染

转染当天，记录细胞密度(mioc/ml)，取细胞适量离心,1300rpm，3min；用新鲜溶液(31℃，提前预热)重悬，使细胞终密度为5mioc/ml。离心时，将质粒dna与pei在干净的离心管中预混，轻轻吹打，室温孵育3-5min。处理好的dna&pei混合物，加入到准备的细胞中，摇晃混匀，31℃培养。转然后10min，加入适量的dmso，摇晃混匀，31℃培养。转染后取样品进行检测。其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染，含a亚基基因序列和b亚基基因序列的重组质粒共转染至cho细胞。

2.4蛋白表达鉴定

(1)制样

取培养了数天的细胞80ul，1300rpm离心3min后，分别收集上清和细胞沉淀，吸取上清约80ul加入20ul的5×loadingbuffer混匀，细胞加入80ul1×pbs(ph7.5)的缓冲液重悬细胞后加入20μl(reduced)5×loadingbuffer混匀后，100℃煮样8min，12000rpm离心1min待用/储存于-20℃冰箱。

(2)sds-page

电泳第一块胶：事先配置的12％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样15μl，用80v电压跑至样品出浓缩胶后将电压调为120v后电泳约90min。第二块胶：事先配置的12％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样15μl，用80v电压跑至样品出浓缩胶后将电压调为120v后电泳约90min。如图2所示，其中，m为蛋白marker；cell为细胞破碎液；sup为细胞培养上清液。

(3)westernblot

80ma转膜40min，加入5％脱脂奶粉室温封闭1h。特异性抗体按照1：5000的比例室温孵育2h；tbst洗涤3次，每次5min；兔源抗igg抗体室温孵育1h；pbst洗涤3次，每次5min；ecl显色，曝光1min拍照。如图3所示，其中，m为蛋白marker；cell为细胞破碎液；sup为细胞培养上清液。

3实验结果

sds-page电泳图显示，含有hgfs、heavy、acti、light、ha+hb、la+hb这六种重组载体的细胞破碎液内均检测有与目标蛋白分子量相近的蛋白质，而细胞培养上清液中则近乎没有可见条带。westernblot进一步的检测鉴定显示，除了hgfs之外，heavy、acti、light、ha+hb、la+hb这五种重组载体的细胞破碎液内均检测有目标蛋白的表达，分子量在32kda左右；而细胞培养上清液中没有可见条带。