一种油酸含量相关的芝麻基因及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及与一种与油酸含量相关的芝麻基因sisad，同时还涉及该基因在酿酒酵母微生物初生代谢物分泌和作物品质育种中的应用，油酸含量相关芝麻基因sisad在酿酒酵母细胞和拟南芥中的过量表达表明，此基因可显著提高酿酒酵母细胞和植物种子的油酸含量，应用于微生物油酸含量分泌和作物品质改良。

背景技术：

芝麻(sesamumindicuml.)属胡麻科草本植物，是世界范围内广泛栽培和利用的优质油料和特色经济作物。芝麻种子含油量高，平均可达55％，有“油料皇后”之美称，含有丰富的蛋白质、甾醇、卵磷脂、维生素e等营养成分，以及钙、磷、铁等重要元素。芝麻还富含芝麻素和芝麻酚林等特色保健成分，广受人民喜爱，其需求量和消费量随着人民生活水平的上升而逐年增加。芝麻中脂肪酸含量丰富，主要由亚油酸和油酸组成，其比例分别占芝麻脂肪酸总量的44.32％和42.18％。

油酸是含有一个双键的单不饱和脂肪酸，是天然不饱和脂肪酸中最常见的一种。在植物油脂中，油酸主要以甘油脂的形式存在，在不同的植物油中，油酸的含量差异较大，如橄榄油和茶油中油酸含量可达80.0％、花生油约含60.0％，大豆油、向日葵籽油和棉籽油的油酸含量分别为35.5％、34.0％和30.0％、而菜籽油和红花油的油酸含量只有23.9％和18.7％。作为植物油的主要成分之一，油酸的氧化稳定性高于其他多不饱和脂肪酸，含油酸较多的植物油货架期较长，容易储存。另外，油酸营养和保健功能明显，可预防动脉粥样硬化等疾病的发生。同时，油酸在工业用途中扮演重要的角色。可应用于纺织皮革、化妆美容以及制药等行业；可用于制作干燥剂、润滑剂及防水剂等。因此油酸还是一种优异的化学试剂。

硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶(stearoylacyl-carrier-proteindesaturase，sad)是质体中的一种可溶性酶，催化硬脂酸烃链脱饱和，在其烃链第9、10位间生成双键，合成油酸，其不仅是硬脂酸向油酸转化的唯一催化酶，更是其他不饱和脂肪酸生成的前提，因此sad酶对植物脂肪酸中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量比例的调控作用显著(damudehgetal.,2006)。sad基因编码硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和酶(sad酶)，同时也是植物脂肪酸调控的关键基因之一。目前，许多植物中的sad基因已经被分离克隆出来，如蓖麻、油菜、亚麻、菠菜、土豆等。利用转基因技术将玉米sad基因zmsad1在拟南芥种子中进行特异性过量表达，通过rna干扰转zmsad1拟南芥种子中油酸的含量显著降低。aardrakachroo等(2007)在拟南芥基因组中发现7个编码sad酶的基因，组成s-acp-des家族，家族成员之间的保守性很强，且7个基因在不同组织中具有组织表达特异性，同时具有底物特异性；在拟南芥ssi2/fab2突变体中，此突变基因编码反义硬脂酰酰基脱饱和酶，使得拟南芥中突变体的硬脂酸(c18:0)含量升高，油酸水平降低。本发明中提到的植物油酸含量相关基因sisad及其编码蛋白，与拟南芥同源基因(at1g43800.1)同源度分别为73％和79％。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种油酸含量相关的芝麻(sesamumindicuml.)基因sifad2、编码蛋白及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种油酸含量相关的芝麻(sesamumindicuml.)基因sisad，该基因的核苷酸序列为seqidno.1所示，或为由该序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有同等功能的核苷酸序列。通过将油酸含量相关芝麻基因sisad在酿酒酵母和拟南芥中的过量表达，发现此基因可显著提高酿酒酵母细胞和植物种子的油酸含量，为微生物油酸含量分泌和植物品质改良提供基因资源。

本发明还包括提供一种芝麻sisad蛋白，其具有如seqidno.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明包括通过各种方法获得的、如seqidno.2所示氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。

本发明还包括含有sisad核苷酸序列的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞如含有所述载体的转化酿酒酵母细胞。

本发明将sisad基因构建到表达载体pyes2。通过热激转化方法，将pyes2携带的sisad基因转入酿酒酵母细胞中，获得酿酒酵母转化细胞。实验结果表明，sisad具有提高酿酒酵母细胞的油酸含量。

本发明将sisad基因构建到表达载体pbi121。通过农杆菌介导转化方法，将pbi121携带的sisad基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。实验结果表明，sisad具有提高植物种子油酸含量作用。

本发明还提供上述sisad基因、载体或宿主细胞在提高酿酒酵母细胞油酸含量中的应用。

本发明还提供上述sisad基因、载体或宿主细胞在提高植物种子油酸含量中的应用。

本发明所述的一种提高油酸含量的芝麻基因sisad获得方法，包括如下步骤：

(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；

(2)利用illuminahiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)结合种质资源群体中的种子油酸含量数据、基因型数据和群体结构，采用emmax软件包和peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10^-6.48水平检测到1个位于3号连锁群上24095650的位置与芝麻油酸含量显著关联的标记位点，解释4.5％的表型变异；

(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现距离显著关联标记位点11914bp的位置存在sin_1008977基因，该基因的拟南芥同源基因为sad，是拟南芥油酸合成基因，因此，推测该基因可能与芝麻油酸含量相关，命名为sisad；

(5)根据sisad基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列及名称如下：

sisad-f：5’-tctagaatgcaatcatcagc-3’

sisad-r：5’-gagctcctacacaactactt-3’；

(6)取中芝13发育25天的蒴果，提取种子总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用步骤(5)中的引物sifad-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得提高油酸含量的芝麻sisad基因序列，如seqidno.1所示；

克隆本发明中所述的油酸含量相关的基因sisad的方法是本领域中所常用的方法。提取植物叶片dna是常用的分子生物学技术，提取mrna的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(easyspinplusplantrnakit)可从商业途径获得(购于aidlabbiotechnologiesco.,ltd)。构建本发明中所述的载体和将载体转入植株所用到的酶切、连接、酵母转化、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pbi121和pyes2)，转染用媒体(如酿酒酵母菌株invsc1、根癌农杆菌gv3101和所用试剂成分如蔗糖、kan等)可从商业途径获得。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明是国内外首次公开油酸含量相关芝麻基因sisad序列，目前其过量表达可提高酿酒酵母细胞和植物种子油酸含量的功能没有相关报道。通过油酸含量相关芝麻基因sisad在酿酒酵母细胞和拟南芥中的过量表达实验表明：转基因酿酒酵母和拟南芥sisad的含量与受体对照(非转基因酵母细胞和植株)相比均有很大程度的提高，酵母细胞和拟南芥种子油酸含量也因此得到提高。因此本发明提出可利用sisad的过量表达来提高微生物细胞的油酸含量，改良微生物菌株的出油品质；以及利用sisad的过量表达来提高植物种子的油酸含量以便用于油料作物高油酸品种的选育，由此来提高食用油的品质，改善人们膳食营养。

附图说明

图1为含sisad基因的酿酒酵母表达载体pyes2-sad的构建；

图2转sisad基因酵母菌株的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-6：阴性菌株；7-11：阳性菌株；空：转空载体菌株)；

图3阳性酵母菌株定量表达验证结果图；

图4气相色谱法测定转sisad基因酵母各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量；

图5为含sisad基因的植物表达载体pbi121-sad的构建；

图6转sisad基因拟南芥t1代阳性植株的筛选结果示意图；

图7转sisad基因拟南芥t1代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；阳：阳性对照；阴：阴性对照；1-22：转基因t1代植株)；

图8转sisad基因拟南芥t2代阳性植株的筛选结果示意图；

图9转sisad基因拟南芥t2代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-24：转基因t2代植株)；

图10转sisad基因拟南芥t2代植株定量表达验证结果图；

图11气相色谱法测定转sisad基因拟南芥种子各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量。

具体实施方式

通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)，或draper等人(blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1：油酸含量相关芝麻基因sisad的获得

本发明所述的一种油酸含量相关芝麻基因sisad获得方法，包括如下步骤：

(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；

(2)利用illuminahiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)结合种质资源群体中的种子油酸含量数据、基因型数据和群体结构，采用emmax软件包和peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10^-6.48水平检测到1个位于3号连锁群上24095650的位置与芝麻油酸含量显著关联的标记位点，解释4.5％的表型变异；

(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现距离显著关联标记位点11914bp的位置存在sin_1008977基因，该基因的拟南芥同源基因为sad，是拟南芥油酸合成基因，因此，推测该基因可能与芝麻油酸含量相关，命名为sisad；

(5)根据sisad基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列及名称如下：

sisad-f：5’-tctagaatgcaatcatcagc-3’

sisad-r：5’-gagctcctacacaactactt-3’；

(6)取中芝13发育25天的蒴果，提取种子总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用步骤(5)中的引物sifad-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得一种提高油酸含量的芝麻基因sisad，其序列为seqidno.1所示。

实施例2：一种提高油酸含量相关的芝麻基因sisad在提高酿酒酵母细胞油酸含量中的应用

1)将实施例1克隆得到的油酸含量相关的芝麻基因sisad利用同源重组的方法与pyes2(vazyme公司)质粒连接构建植物表达载体，命名为pyes2-sad(图1)；

2)将步骤1)中制备的载体pyes2-sad转入酿酒酵母invsc1中(invitrogen公司)；

3)转基因酵母阳性检测

挑取步骤2)中获得的酵母单克隆5-15个到sd-u基础培养基中，30℃振荡过夜培养，提取酵母质粒，利用sisad-1f/1r引物，进行pcr检测(图2)，获得转基因阳性酵母。酵母质粒提取方法参照北京天根生物技术公司酵母质粒小提试剂盒。

sisad-1f：5’-cattgccaacttaccaga-3’

sisad-1r：5’-tcgcctacggctatca-3’

4)阳性酵母菌株定量表达验证

取阳性酵母菌株以及转pyes2空载体酿酒酵母菌株为对照的同一批繁殖培养的菌株，通过诱导培养基诱导培养，利用easyspin酵母rna快速提取试剂盒(艾德莱生物)提取各菌液rna，并反转录cdna，以各自cdna为模板，以pyes2载体上的ura3基因为内参(pf：5’-gctggccgcatcttctcaaa-3’；pr：5’-tatcggctttattgctcaaa-3’)，进行qrt-pcr表达验证。结果表明以转pyes2空载体酿酒酵母菌株为对照，芝麻sisad基因在3个酵母转基因菌株中具有较大的差异表达，而在转pyes2空载体酵母对照菌株中，没有检测到芝麻sisad基因的表达(图3)。表明芝麻的sisad基因均转化并插入到了相应酵母基因组中并得到了表达。

5)转基因酵母油酸含量分析

分别挑取转pyes2-sad基因单克隆和转pyes2空载体酿酒酵母菌株进行诱导培养基诱导培养，当od＝2.0时低温离心收集菌体，收集的菌体于-80℃冷冻30min，并于冷冻干燥机中干燥，然后利用气相色谱法分别测定转基因酵母和转pyes2空载体酿酒酵母菌株中的油酸含量。结果表明测试的转sisad基因的酵母菌株较转pyes2空载酵母菌株油酸(c18:1)含量有显著的升高(图4)。通过芝麻sisad基因的过量表达，酵母菌株中油酸含量明显升高。

实施例3：一种提高油酸含量相关的芝麻基因sisad在植物品质改良育种中的应用

1)将实施例1克隆得到的油酸含量相关的芝麻基因sisad利用同源重组的方法与pbi121(vazyme公司)质粒连接构建植物表达载体，命名为pbi121-sad(图5)；

2)将步骤1)中制备的载体pbi121-sad转入根癌农杆菌gv3101(invitrogen公司)，再导入拟南芥植株中；

3)筛选t1代阳性植株。

种植拟南芥t0代所收获的种子，将t0代种子消毒，接种含卡那霉素的ms筛选培养基上筛选阳性植株(图6)。筛选出的阳性植株的叶片dna提取后，利用pcr鉴定引物sisad-f/r，进行转基因植株的pcr分子鉴定(图7)，最终确认基因已经转入的t1代阳性植株。

4)转基因植株t2代阳性检测

将t1代阳性植株进行单株收种获得t1代种子，继续进行卡那霉素筛选获得t2代阳性植株(图8)，获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组dna进行pcr分子鉴定(图9)，确定t2代阳性植株。

5)转基因植株t2代阳性植株定量表达验证

生长时期的幼嫩角果，各自cdna为模板，以拟南芥β-actin为内参(af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’；ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’)，进行qrt-pcr表达验证。结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照，芝麻sisad基因在3个拟南芥转基因株系的角果中具有较大的差异表达，而在未转基因对照拟南芥的角果中，没有检测到芝麻sisad基因的表达(图10)。表明芝麻的sisad基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达。

6)t2代阳性拟南芥种子油酸含量的测定

待t2代转基因种子成熟后，收集种子，利用气相色谱法分别测定拟南芥转基因种子和未转基因野生型拟南芥种子中油酸含量。结果表明与野生型拟南芥对照相比，本研究所获得的转sisad基因拟南芥株系油酸(c18:1)含量明显升高(图11)，表明芝麻sisad基因的过量表达可以促进硬脂酸向油酸转化，从而提高植物种子的油酸含量。

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种油酸含量相关的芝麻基因及其应用

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