一种特异性敲减人BRCC3基因慢病毒的构建及在肺癌中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体涉及一种乳腺癌易感基因复合物亚基基因brcc3及2个稳定敲减brcc3基因重组质粒的构建及其在肺癌中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一，是全球第二大致死性疾病。其中，肺癌是全球癌性死亡的首要原因，也是导致我国城乡居民死亡的罪魁祸首，其发病率和死亡率仍在不断上升。肺癌起病隐匿，早期不易发现，确诊时多属晚期，手术、化疗、放疗仍是治疗肺癌的主要方法，但是，即使根治性手术也不能避免全身转移，化疗、放疗杀伤作用没有针对性，且长期放化疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能，甚至诱发新的癌变。因此，迫切需要找到新的方法和思路来解决这一难题。

随着分子生物学及免疫组学的不断发展，人们把越来越多的目光投到以基因和蛋白为基础的靶向治疗上。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对致癌位点(肿瘤细胞内部的蛋白分子、基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内特异地与致癌位点结合，使肿瘤细胞死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为"生物导弹"。由此可知，在分子靶向治疗中，寻找合适的治疗靶点至关重要。

brcc3是乳腺癌易感基因复合物亚基3，是2003年从brcc复合物中发现的一种含锌jamm/mpn+类去泛素化酶，由316个氨基酸组成，分子量约为36kda。既往对brcc3的研究主要集中于其在正常生理过程中的作用，如调控细胞周期检查点、dna损伤修复、细胞有丝分裂等多种细胞活动，在血管生成、心肌缺血再灌注、心肌凋亡等过程中发挥重要作用。近年来，有研究发现，brcc3在乳腺癌、鼻咽癌中高表达，可作为预后标志物，促进肿瘤细胞增殖，参与放疗耐受和化疗耐药，可作为肿瘤生物治疗潜在靶点，但其具体机制及在肺癌中的作用仍未阐明。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对brcc3基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种能特异性敲减brcc3基因的shrna序列及慢病毒的制备方法，并进一步验证该慢病毒对肺癌细胞的作用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

step1,通过pcr合成能特异性敲减人brcc3基因的shrna序列；

step2,构建能特异性干扰brcc3基因的重组质粒；

step3,包装能特异性干扰brcc3基因的慢病毒；

step4,筛选验证step3中的能够特异性干扰brcc3基因的慢病毒；

step5,观察step3中能够特异性干扰brcc3基因的慢病毒对肺癌细胞生物学功能的影响。

进一步的，步骤step1中，包含如下步骤：

(1):利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人brcc3基因的转录本及编码(cds)区信息。

(2):针对人brcc3基因的编码区，设计2个能特异性敲减人brcc3基因的核苷酸序列。

(3)根据gv248载体及step2中设计的shrna序列，选择合适的限制性内切酶(agei和ecori)，分别于靶序列的5’端和3’端加上agei、ecori限制性内切酶位点，化学合成该shrna序列(单链引物)。

进一步的，所述的gv248载体，可以替换成其他作为构建干扰慢性病毒的载体，如psh-h1-gfp,psh-u6-gfp,plent-u6-puro,pav-h1-gfp等。挑选此类作为构建干扰慢病毒的载体的方法在于：1.能够稳定、高效沉默/干扰目的基因；2.能高效感染细胞；3.带有绿色荧光标记，便于观察；4.带有嘌呤霉素抗性，必要时便于筛选稳定细胞株。

(4):将上一步中合成的单链引物粉末溶于退火缓冲液中，90℃水浴15min，待其自然冷却至室温，形成双链dna。

(5)载体酶切：根据限制性内切酶说明书，配制50l酶切反应体系，将其置于37℃酶切过夜。

(6):用dna纯化试剂盒对上述载体酶切产物进行纯化。

进一步的，步骤step2中，包含如下步骤：

(1):用t4dna连接酶将step1(4)中的双链dna与酶切纯化后的载体进行连接，16℃连接过夜。

(2):重组质粒的转化：将10l连接反应液加入150l感受态细胞中，轻微混匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，冰水孵育2min。加入1mllb培养基，置于37℃摇床振荡(100rpm)培养1h。4000rpm离心2min，去上清，加入150l含有氨苄青霉素的lb培养基，轻微混匀，将其均匀涂布于含有氨苄青霉素的细菌培养平板上，37℃倒置培养15h。(3):挑选单克隆菌落，置于1ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃摇床振荡(230rpm)培养7h，取1l菌液用能特异扩增brcc3基因的引物进行pcr反应。并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。

进一步的，步骤step3中，包含如下步骤：

(1):取部分上一步中鉴定出的阳性菌液进行测序，将测序结果与step1中所设计的shrna序列进行比对，若序列一致，则该菌液即为正确克隆的菌液。

(2):提取质粒：将测序正确的菌液接种于15ml含氨苄青霉素的lb培养基中，于37℃摇床振荡(230rpm)培养过夜，用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书进行质粒抽提。

(3):扩大培养携带phelper1.0和phelper2.0质粒的菌液，用天根质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提。

进一步的，如上步骤中除了可以使用phelper1.0和phelper2.0，还可以使用pspax2和pmd2g等。

(4):将5×10⁶个处于对数生长期的293t细胞接种于10cm培养皿中，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。

进一步的，因为293t细胞适宜的包膜和高表达反转录酶，能提高慢病毒的滴度，故此处用来包装产生慢病毒。

(5):将培基更换为无血清培养基。设计实验组和对照组：向一无菌ep管中分别加入20ggv248质粒、15gphelper1.0质粒、10gphelper2.0质粒和相应体积的lip2000，混合均匀，室温孵育20min。其中，实验组中的gv248质粒为已经连接上shrna序列的gv248质粒，对照组为未连接上shrna序列的gv248质粒。

(6):将上述质粒混合液缓慢加入293t细胞中，混匀，于37℃、5％co2培养箱中培养，6h后更换为含有10％胎牛血清的培养基，于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h。

(7):收集转染48h后的293t细胞上清液，于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片，收集病毒颗粒。

进一步的，步骤step4中，包含以下两种方法：

验证步骤step3中慢病毒的方法，其特征在于直接利用westernblot验证brcc3蛋白的表达，内参蛋白为α-tubulin。

验证步骤step3中慢病毒的方法，其特征在于采用实施荧光定量pcr。

1.进一步的，步骤step5中，检测step3中慢病毒对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：

(1)细胞增殖活性检测(mts法)：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5％co237℃培养箱中培养1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测7天。

(2)克隆形成实验：将200个生长状态良好细胞接种于6孔板，置于5％co2、37℃培养箱中培养14天后终止培养。pbs洗涤2次后加甲醇固定15分钟，加适量苏木素染色液染10～30分钟，流水冲洗后扫描拍照。肉眼直接计数克隆或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率＝克隆数/接种数×100％

(3)流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2m柠檬酸/柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×pbs洗2次，0.1％triton(pbs配制)洗1次，再用500μg/mlpi和0.1％rnaasea，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。

本发明的有益效果如下：

1.本发明构建的重组质粒(菌液)可批量扩增，大量包装慢病毒，满足多个分子生物学研究。

2.用该慢病毒感染两株人肺癌细胞系，westernblot检测发现，两株人肺癌细胞系中brcc3蛋白表达均降低，结果表明本发明所构建的两个慢病毒均能明显抑制内源性brcc3的表达。

3.mts法检测细胞增殖表明，与转染对照慢病毒相比，转染本发明中的两个慢病毒可以抑制肺癌细胞的增殖能力。

4.平板克隆形成实验表明，与转染对照慢病毒相比，转染本发明中的两个慢病毒均能抑制肺癌细胞的克隆形成能力。

5.流式细胞术检测肺癌细胞周期表明，与转染对照慢病毒相比，转染本发明中的两个慢病毒均能抑制肺癌细胞的细胞周期进程，使其阻滞于g1期。

附图说明

图1为构建敲减brcc3基因重组质粒的gv248载体结构图；

图2为两种慢病毒对肺癌细胞中brcc3蛋白的抑制情况鉴定；

图3为两种慢病毒对肺癌细胞增殖能力的抑制情况；

图4为两种慢病毒对肺癌细胞克隆形成能力的抑制情况；

图5为两种慢病毒对肺癌细胞细胞周期的阻滞情况。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

具体实施方式1：

构建能特异性干扰人brcc3基因的重组质粒及慢病毒的包装，本发明的具体实施过程为：

1.一种能特异性干扰brcc3基因的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

step1:利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人brcc3基因的转录本及编码(cds)区信息(转录本1：nm_024332.3，cds区为109-1059，具体序列见序列表)。

step2:针对人brcc3基因的cds区，设计2个能特异性敲减人brcc3基因的shrna序列。

step3:根据gv248载体及step2中设计的shrna序列，选择合适的限制性内切酶(agei和ecori)，分别于靶序列的5’端和3’端加上agei、ecori限制性内切酶位点，化学合成该shrna序列(单链引物)。

如图1所示，为gv248载体结构图，从图1可以看出本发明设计的2个特异性敲减人brcc3基因shrna序列所连接的位置，为mcs区域。

step4:将step3中合成的单链引物粉末溶于退火缓冲液中，90℃水浴15min，待其自然冷却至室温，形成双链dna。

step5:载体酶切：根据限制性内切酶说明书，配制50μl酶切反应体系，将其置于37℃酶切过夜。

step6:用dna纯化试剂盒对上述载体酶切产物进行纯化。

step7:用t4dna连接酶将(4)中的双链dna与酶切纯化后的载体进行连接，16℃连接过夜。

step8:重组质粒的转化：将10μl连接反应液加入150μl感受态细胞中，轻微混匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，冰水孵育2min。加入1mllb培养基，置于37℃摇床振荡(100rpm)培养1h。4000rpm离心2min，去上清，加入150μl含有氨苄青霉素的lb培养基，轻微混匀，将其均匀涂布于含有氨苄青霉素的细菌培养平板上，37℃倒置培养15h。

step9:挑选单克隆菌落，置于1ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃摇床振荡(230rpm)培养7h，取1μl菌液用能特异扩增brcc3基因的引物进行pcr反应。并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。

step10:取部分step9中鉴定出的阳性菌液进行测序，将测序结果与step2中所设计的shrna序列进行比对，若序列一致，则该菌液即为正确克隆的菌液。

step11:提取质粒：将测序正确的菌液接种于15ml含氨苄青霉素的lb培养基中，于37℃摇床振荡(230rpm)培养过夜，用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书进行质粒抽提。

2.包装能特异性干扰brcc3基因的慢病毒的方法，包括以下步骤：

step1:扩大培养携带phelper1.0和phelper2.0质粒的菌液，用天根质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提。

step2:将5×10⁶个处于对数生长期的293t细胞接种于10cm培养皿中，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。

step3:将培基更换为无血清培养基。向一无菌ep管中分别加入20μggv248质粒、15μgphelper1.0质粒、10μgphelper2.0质粒和相应体积的lip2000，混合均匀，室温孵育20min。

step4:将上述质粒混合液缓慢加入293t细胞中，混匀，于37℃、5％co2培养箱中培养，6h后更换为含有10％胎牛血清的培养基，于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h。

step5:收集转染48h后的293t细胞上清液，于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片，收集病毒颗粒。

具体实施方式2：

稳定干扰brcc3基因的人肺癌细胞系的构建，包括以下步骤：

step1:复苏a549和pc-9人肺癌细胞，用含10％的胎牛血清的rpmi-1640培养基于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养细胞。

step2:将处于对数生长期的a549和pc-9细胞接种于24孔培养板中(10⁴个/孔)，8小时后进行慢病毒感染。

step3:弃step2中孔内培养基，每孔加入100ul含10％的胎牛血清的rpmi-1640培养基。

step4:取1.5mlep管，分别向管中加入400ulopti-men无血清培养基、1ul5mg/mlpolybrene促感染剂、200ul慢病毒颗粒，轻柔混匀。

step5:将step4中的慢病毒混合液加入step3的孔内，轻柔摇匀，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养，10小时后更换新鲜培养基，逐渐扩大培养。

step6:用ripa细胞裂解液(按100:1加入蛋白酶抑制剂)裂解处于对数生长期的细胞提取总蛋白，用bca法测蛋白浓度并于95℃水浴10min变性蛋白。

step7:利用westernblot验证brcc3蛋白的表达，内参蛋白为α-tubulin。

如图2所示，为westernblot验证稳定干扰人brcc3基因的肺癌细胞系构建情况，从图2可以看出，与阴性对照慢病毒比较，本发明设计包装的2个慢病毒均使brcc3蛋白表达降低，说明本发明设计的2个shrna序列均能明显抑制人brcc3基因的表达，本发明构建的2个质粒均能抑制人brcc3基因的表达，本发明包装的2个慢病毒均能稳定干扰brcc3基因表达，本发明构建的2株稳定干扰brcc3基因的人肺癌细胞系构建成功，可用于后续研究。

具体实施方式3：

稳定干扰brcc3对肺癌细胞生物学功能的影响，包括以下方法及步骤：

(1)细胞增殖活性检测(mts法)：将10³个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5％co237℃培养箱中培养1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测7天。

如图3所示，为稳定干扰人brcc3基因后肺癌细胞增殖能力的变化，从图3可以看出，与阴性对照组细胞比较，稳定干扰brcc3基因后，a549和pc-9肺癌细胞增殖能力明显减慢，说明本发明包装的两个慢病毒，抑制brcc3基因后，均能抑制肺癌细胞的增殖能力。

(2)克隆形成实验：将200个生长状态良好细胞接种于6孔板，置于5％co2、37℃培养箱中培养14天后终止培养。pbs洗涤2次后加甲醇固定15分钟，加适量苏木素染色液染10～30分钟，流水冲洗后扫描拍照。肉眼直接计数克隆或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率＝克隆数/接种数×100％

如图4所示，为稳定干扰人brcc3基因后肺癌细胞克隆形成能力的变化，从图4可以看出，与阴性对照组细胞比较，稳定干扰brcc3基因后，a549和pc-9肺癌细胞形成的克隆数明显减少，说明本发明包装的两个慢病毒，抑制brcc3基因后，均能抑制肺癌细胞的克隆形成能力。

(3)流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×10⁶个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2m柠檬酸/柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×pbs洗2次，0.1％triton(pbs配制)洗1次，再用500μg/mlpi和0.1％rnaasea，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。

如图5所示，为稳定干扰人brcc3基因后肺癌细胞周期的变化，从图5可以看出，与阴性对照组细胞比较，稳定干扰brcc3基因后，a549和pc-9肺癌细胞处于g1期细胞比例增加，说明本发明包装的两个慢病毒，抑制brcc3基因后，均能使肺癌细胞的细胞周期阻滞于g1期。

以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

第一个序列表：人brcc3基因（cds区为109-1059）

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第二个序列表：特异性敲减人brcc3基因的shrna序列表

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第三个序列表：特异性敲减人brcc3基因的shrna序列表

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