一种的微生物菌株及其选育方法和应用与流程

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种用于制备双降醇的微生物菌株及其选育方法和应用。

背景技术：

甾体药物是品种多和应用广泛的一大类药物，临床上需求量仅次于抗生素，主要用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等疾病。我国在甾体药物研究开发与世界先进国家相比还有一定的差距，主要表现为甾体药物合成步骤多，反应复杂，基团的远程效应十分明显，收率低，特别是分离纯化困难。图1为植物甾醇转化双降醇的途径及关键酶系。

双降醇(21-hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-one)分子式为c22h34o2，分子量为330.5，是甾体激素类药物的一种重要中间体，可以用作甾体药物黄体酮和氢化可的松的合成，具有重要的商业价值。微生物降解植物甾醇的的工作开始于20世纪60年代，目前已经发现许多微生物可以降解植物甾醇，包括arthrobacter，brevibacterium，pseudomonas，nocardia，bacii/us，streptomyces，microbacterium，achromobacter，protaminobacter，comamonas，mycobacterium；fijrhodococcus等菌种，微生物通过体内酶系高效降解植物甾醇侧链以及氧化母核环。研究表明，9-羟化酶ksha与kshb共同催化形成9-羟基雄烯二酮，从而进一步催化最终降解为二氧化碳和水。研究表明，c22脱氢酶是植物甾醇生成4-雄烯二酮与双降醇的关键酶系，脱氢活力较高时主要向4-雄烯二酮转化，而相对较弱时主要向双降醇途径转化。此外也有研究表明，3-甾酮-δ¹-脱氢酶(3-ketosteroiddelta1-dehydrogenase)可以促使4-雄烯二酮与双降醇分别转化为1，4-雄烯二酮与1，4-双降醇。湖北共同生物科技有限公司通过诱变方法(专利号cn103382445a)成功获得9-羟化酶缺陷菌株，保藏在武汉大学中国典型微生物保藏中心，编号为cctccno:m2012522。本发明在前期的诱变株基础之上进一步采用紫外线-licl以及亚硝基胍复合诱变方法得到c1，2脱氢酶以及c22脱氢酶双重缺陷菌株，从而富集转化生产双降醇。

技术实现要素：

本发明的目在于提供一种用于制备双降醇的微生物菌株及其选育方法和应用，得到遗传性状稳定的双降醇生产菌株，同时优化提取工艺，获得高纯度的双降醇精制产品。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种微生物菌株，为分枝杆菌属分支杆菌种，拉丁文为mycobacteriumsp.hbcba-1，保藏单位为中国典型菌种保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期为2017年6月19日，保藏号为cctccno：m2017349，主要特征为细胞为杆状，革兰氏染色为阳性g+，过氧化氢酶阳性，v.p.反应、甲基红试验以及吲哚试验均为阴性。

一种上述菌株的选育方法，包括以下步骤：

1、菌株及活化：属于放线菌中的分枝杆菌属分枝杆菌种，拉丁名为mycobacteriumsp，名称为mycobacteriumsp.gtf-69，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址在中国武汉武汉大学，保藏日期2012年12月11日，保藏号cctccn0:m2012522。将保藏于冷冻甘油管中的分支杆菌采用固体活化培养基接种于斜面或者平板划线活化，28～30℃，2～4天。固体活化培养基配方为(质量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，ph6.8～7.0。

2、紫外-licl复合诱变：将上述活化好的分支杆菌挑取单菌落转入液体培养基中，28～30℃，180～220rpm，2～4d。液体培养基配方为(质量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，ph6.8～7.0。制成第一菌悬液，浓度为10⁷～10⁸个/ml，对第一菌悬液采用紫外诱变，诱变条件为：紫外灯功率15w，距离为30cm，照射时间为2～8min，将诱变后的第一菌悬液避光进行梯度稀释，然后涂布在lic1质量浓度分别为0.02％～0.1％的固体活化培养基平板培养基上，28～30℃，3～5d。分离单菌落采用活化培养基活化，28～30℃，180～220rpm，2～3d，取活化后的菌液按2％的接种量接种于种子培养基中，28～32℃，200～250rpm，24～36h。种子培养基配方为(质量百分比)：葡萄糖2％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，ph7.0～7.2。然后按10～15％的接种量接种于发酵培养基，28～32℃，200～250rpm，4～8d，通过tlc定性分析筛选获得突变株。发酵培养基配方为(质量百分比)：植物甾醇3％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，豆饼油14～18％，ph7.0～7.2。

3、亚硝基胍诱变：将紫外-licl复合诱变筛选的突变株采用液体培养基活化培养，28～30℃，180～220rpm，2～4d，制成第二菌悬液，浓度为10⁷～10⁸个/ml。对第二菌悬液采用亚硝基胍诱变处理，亚硝基胍浓度为40～100μg/ml，诱变时间为20～60min，诱变后将第二菌悬液稀释1000倍，终止诱变，涂布固体活化培养基的平板培养，28～30℃，3～5d。分离单菌落采用活化培养基活化，28～30℃，180～220rpm，2～3d，取活化后的菌液按2％的接种量接种于种子培养基中，28～32℃，200～250rpm，24～36h。通过tlc定性分析筛选获得本发明所述的微生物菌株。

一种上述微生物菌株的应用，将其用于双降醇的提取与精制：将上述菌株按10～15％的接种量接种于发酵培养基，28～32℃，200～250rpm，4～8d，将3l发酵液注入到一个5～8l玻璃瓶，搅拌，水浴加热至70～80℃，用稀硫酸中和至ph3～3.5，加3～6％珍珠岩助滤剂，搅拌1～2h，加20～30ml聚合氯化铝和0.5～2g聚丙烯酰胺，持续搅拌2～3h，停止加热，排出热水，用冷水浴降至45～50℃，过滤油相尽可能抽干，得到黄色粉状滤饼。将黄色粉状滤饼加至5～10l玻璃瓶，搅拌，加入备好的3～5l甲醇溶液(体积比80％)，室温搅拌2～3h，过滤抽干，重复提取2～4次，合并滤液，常压蒸馏掉甲醇，降至室温，过滤得到滤饼，抽干，烘干，得到粗品。将400～600ml甲醇水溶液(体积比80％)注入1～2l三角瓶，加入以上粗品并搅拌，用水浴加热至50～60℃，直至完全溶解，再加入2～3.5g活性炭，保持2～3h，压滤，将滤液常压蒸馏至原体积的一半，常温放置分出结晶，过滤，抽干，烘干得到成品。

附图说明

图1植物甾醇转化双降醇的途径及关键酶系；

图2双降醇成品hplc分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1复合诱变获得双降醇生产菌株

1、出发菌株：属于放线菌中的分枝杆菌属分枝杆菌种，拉丁名为mycobacteriumsp，名称为mycobacteriumsp.gtf-69，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址在中国武汉武汉大学，保藏日期2012年12月11日，保藏号cctccn0:m2012522。

2、菌株活化：将保藏于冷冻甘油管中的分支杆菌采用固体活化培养基接种于斜面或者平板划线活化，30℃，4d。固体活化培养基配方为(质量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，ph7.0。

3、紫外-licl复合诱变：将上述活化好的分支杆菌挑取单菌落转入液体培养基中，30℃，200rpm，3d。液体培养基配方为(质量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，ph7.0。制成第一菌悬液，浓度为10⁷个/ml，对第一菌悬液采用紫外诱变。诱变条件为：紫外灯功率15w，距离为30cm，照射时间为6min，将诱变后的第一菌悬液避光进行梯度稀释，然后涂布在lic1质量浓度为0.06％的固体活化培养基平板培养基上，30℃，5d。分离单菌落采用活化培养基活化，30℃，200rpm，2d，取活化后的菌液按2％的接种量接种于种子培养基中，32℃，220rpm，24h。种子培养基配方为(质量百分比)：葡萄糖2％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，ph7.0。然后按12％的接种量接种于发酵培养基，32℃，220rpm，5d，通过tlc定性分析筛选获得突变株。发酵培养基配方为(质量百分比)：植物甾醇3％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，豆饼油16％，ph7.0。

3、亚硝基胍诱变：将紫外-licl复合诱变筛选的突变株采用液体培养基活化培养，30℃，200rpm，2d，制成第二菌悬液，浓度为10⁸个/ml。对第二菌悬液采用亚硝基胍诱变处理，亚硝基胍浓度为60μg/ml，诱变时间为40min，诱变后将第二菌悬液稀释1000倍，终止诱变，涂布固体活化培养基的平板培养，30℃，5d。分离单菌落采用活化培养基活化，30℃，200rpm，3d，取活化后的菌液按2％的接种量接种于种子培养基中，32℃，220rpm，24h。通过tlc定性分析筛选获得本发明的微生物菌株。

本发明筛选得到的微生物菌株遗传性状稳定，经过传代20代后生理生化特性都一致。

实施例2双降醇分离纯化与精制

1、粗提：将所述菌株按12％的接种量接种于发酵培养基，32℃，220rpm，5d，将3l发酵液注入到一个5l玻璃瓶，搅拌，水浴加热至80℃，用稀硫酸中和至ph3.5，加3％珍珠岩助滤剂，搅拌1h，加20ml聚合氯化铝和1g聚丙烯酰胺，持续搅拌2h，停止加热，排出热水，用冷水浴降至50℃，过滤油相尽可能抽干，得到黄色粉状滤饼。

2、采用甲醇溶液提取粗品：将黄色粉状滤饼加至10l玻璃瓶，搅拌，加入备好的3l甲醇溶液(体积比80％)，室温搅拌2.5h，过滤抽干，重复提取3次，合并3次滤液，常压蒸馏掉甲醇，降至室温，过滤得到滤饼，抽干，烘干，得到粗品。

3、精制：将400ml甲醇水溶液(体积比80％)注入1l三角瓶，加入以上粗品并搅拌，用水浴加热至60℃，直至完全溶解，再加入3.5g活性炭，保持2h，压滤，将滤液常压蒸馏至原体积的一半，常温放置分出结晶，过滤，抽干，烘干得到成品，通过hplc分析得纯度为98.29％。