与辣椒辣味相关的SNP标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种与辣椒辣味相关的snp标记及其应用。
背景技术：
：辣椒(capsicumspp.)的“辣味”，由辣椒果实特有的辣椒素引起的灼痛感，辣椒辣味的有无为质量性状，由显性pun(最早用c表示)基因位点控制，pun基因的突变导致辣椒辣味的丢失，产生人们所说的甜椒。在辣椒遗传育种中常根据不同的育种目标，选择辣椒或者甜椒育种材料，但往往要等到辣椒果实成熟后才进行选择，比较费时。分子标记辅助育种针对基因型筛选种质资源，避免表型选择的盲目性，大大缩短育种进程，提高育种效率。获得与辣椒辣味性状连锁的分子标记，特别是针对目标基因的关键突变位点开发的功能性分子标记是利用分子标记辅助辣椒辣味转育，实现种质创新的重要条件。虽然基于pcr和电泳技术的分子标记辅助选择可大大提高效率，但仍存在成本较高、通量低等问题。kaspar技术的snp分子标记的高灵敏度和高通量，以及成本较低、易操作等优点在分子标记辅助选择中具有独特优势。技术实现要素：本发明的目的是提供一种与辣椒辣味相关的snp标记及其应用。本发明所提供的应用具体为辣椒基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性或用于检测辣椒基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定辣椒辣味性状中的应用；所述snp位点在辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位点处的核苷酸为a或c。本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定辣椒辣味性状的试剂。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定辣椒辣味性状的试剂，具体是用于检测辣椒基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质；所述snp位点在辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位点处的核苷酸为a或c。具体的，所述“用于检测辣椒基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质”可为如下a)或b)：a)成套单链dna甲，为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1的第22-45位核苷酸所示的单链dna、序列表中序列2的第22-45位核苷酸所示的单链dna、和序列表中序列3所示的单链dna组成的成套单链dna。(a2)由将序列表中序列1的第22-45位核苷酸、序列表中序列2的第22-45位核苷酸和序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三条单链dna分子组成的，且与(a1)中所述成套单链dna功能相同的成套单链dna。b)成套单链dna乙，为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的单链dna、序列表中序列2所示的单链dna、和序列表中序列3所示的单链dna组成的成套单链dna。(b2)由将序列表中序列1、序列2和序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三条单链dna分子组成的，且与(b1)中所述成套单链dna功能相同的成套单链dna。含有所述试剂用于鉴定或辅助鉴定辣椒辣味性状的试剂盒也属于本发明的保护范围。具体的，所述试剂盒中还含有荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b；所述荧光探针a的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位，5’末端连接荧光基团a；所述淬灭探针a的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；所述荧光探针b的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位，5’末端连接荧光基团b；所述淬灭探针b的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。在本发明中，所述荧光基团a具体为fam；所述荧光基团b具体为hex；所述淬灭基团具体为q。在本发明中，所述荧光探针a、所述荧光探针b、所述淬灭探针a和所述淬灭探针b是存在于kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox中的，其中所述kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox为英国lgc公司产品，其产品目录号为kbs-1016-017。所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定辣椒辣味性状中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒为有辣味辣椒还是无辣味辣椒的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测辣椒为有辣味辣椒还是无辣味辣椒的方法，具体可包括如下步骤：检测待测辣椒的基因组中如下snp位点处的核苷酸为a还是c还是a和c，以确定所述待测辣椒的基因型是a:a还是c:c还是a:c，根据所述待测辣椒的基因型按照如下确定所述待测辣椒为有辣味辣椒还是无辣味辣椒：若所述待测辣椒为a:a基因型或a:c基因型，则所述待测辣椒为或候选为有辣味辣椒；若所述待测辣椒为c:c基因型，则所述待测辣椒为或候选为无辣味辣椒。所述snp位点在辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位点处的核苷酸为a或c。所述a:a基因型为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为a的纯合型。所述c:c基因型为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为c的纯合型。所述a:c基因型为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为a和c的杂合型。在所述方法中，所述“检测待测辣椒的基因组中如下snp位点处的核苷酸为a还是c还是a和c”的方法具体可为kaspar检测法。所述kaspar检测法具体可包括如下两个步骤：kaspar扩增和对所述kaspar扩增所得产物进行荧光扫描从而确定所述snp位点处的核苷酸为a还是c还是a和c；所述kaspar扩增的模板为所述待测辣椒的基因组dna，所用的kaspar引物满足如下条件：以所述待测辣椒的基因组dna为模板进行kaspar扩增所得扩增产物的序列含有序列表中序列4。进一步，在所述kaspar检测法中，所述kaspar引物为所述成套单链dna乙(由序列表中序列1、序列2和序列3所示的单链dna组成的成套单链dna)。更加具体的，所述kaspar检测法包括如下步骤：以所述待测辣椒的基因组dna为模板，采用所述试剂盒(kaspar扩增所用引物为所述成套单链dna乙，扩增试剂中含有荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b；所述荧光探针a的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位，5’末端连接荧光基团fam；所述淬灭探针a的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团q；所述荧光探针b的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位，5’末端连接荧光基团hex；所述淬灭探针b的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团q)进行kaspar扩增，然后采用rochelc480进行数据读取，按照如下确定所述待测辣椒基因组中所述snp位点处的核苷酸为a还是c还是a和c：若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经rochelc480分析在所得分型聚类图中呈现蓝色(allelex)，则所述待测辣椒基因组中所述snp位点处的核苷酸为a；若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经rochelc480分析在所得分型聚类图中呈现绿色(alleley)，则所述待测辣椒基因组中所述snp位点处的核苷酸为c；若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经rochelc480分析在所得分型聚类图中呈现红色(bothalleles)，则所述待测辣椒基因组中所述snp位点处的核苷酸为a和c。所述试剂或所述试剂盒或所述方法在辣椒育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂或所述试剂盒或所述方法如下在(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：(a)有辣味辣椒筛选；(b)有辣味辣椒亲本和无辣味辣椒亲本的杂交种的纯度辅助鉴定。如下(a)或(b)的方法也属于本发明的保护范围：(a)培育有辣味辣椒品种的方法，包括选择a:a基因型的辣椒作为亲本进行育种的步骤；所述a:a基因型为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为a的纯合型。(b)培育无辣味辣椒品种的方法，包括选择c:c基因型的辣椒作为亲本进行育种的步骤；所述c:c基因型为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为c的纯合型。在本发明的实施例中，所述辣椒具体选自如下材料或杂交后代(如f1代)：cm334、perennial、小马赛、h3、77013a、0601m、83-60、77013a×cm334、77013a×perennial、77013a×小马赛、77013a×h3、77013a×0601m、83-60×h3、0819、kls、83-163、0516、carolinawonder、dh330、0818、7714、益都红、鸡泽椒、猪大肠、茄门、望都椒、04q-29、04q-15、04q-29×04q-15。本发明的优点是不需通过辣椒果实成熟期鉴定，只是在苗期对辣椒植株的dna检测，就可以判断辣椒辣味的有无，可以广泛应用到分子标记辅助育种。并且该标记可用kaspar基因分型技术进行大批量检测，可以提高效率，缩短鉴定时间。本发明提供的分子标记实现了在苗期对辣味辣椒的筛选和杂交种纯度的鉴定，大大缩短了育种时间，节约了人力物力。通过利用本发明提供的特异性引物并采用kaspar基因分型技术，以已公布全基因组序列具辣味辣椒cm334和zunla_1为对照，与辣味辣椒cm334和zunla_1同基因型的及杂合基因型的具有辣味，与辣味辣椒cm334和zunla_1不同基因型的不具有辣味。通过该分子标记可进行辣椒辣味材料的筛选和杂交种纯度的鉴定，提高了育种效率。相比之前发现的其它分子标记，本发明的snp标记2_25位于辣椒ca02g19240基因区间，属于候选基因分子标记。附图说明图1为kaspar标记2_25在杂交组合中的扩增结果。蓝色点为与有辣味亲本相同基因型的单株(a:a基因型)，绿色点为无辣味材料0601m和77013a(c:c基因型)，红色点为杂合型单株(a:c基因型)。图2为kaspar标记2_25在18个辣椒材料中的扩增结果。蓝色点为有辣味纯合单株(a:a基因型)，绿色点为无辣味单株(c:c基因型)。图3为kaspar标记2_25在有辣味辣椒和无辣味辣椒杂交后代中的扩增结果。蓝色点为无辣味亲本和假杂交f1单株(a:a基因型)，红色点为f1杂交单株(a:c基因型)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所涉及到的辣椒有如下：cm334、perennial、小马赛、h3、77013a、0601m、83-60、0819、kls、83-163、0516、carolinawonder、dh330、0818、7714、益都红、鸡泽椒、猪大肠、茄门、望都椒、04q-29和04q-15。记载有各材料的文献如下所示。实施例1、与辣椒辣味性状相关的snp位点的获得及对应kaspar引物的确定一、试验材料本实施例以有辣味辣椒cm334、perennial、小马赛、h3和无辣味辣椒77013a、0601m、83-60，及其f1为试验材料。二、表型鉴定各辣椒材料及其f1代表型鉴定采用对辣椒成熟果实进行口尝的方法鉴定。每个材料取3株，每株采果3个，分别交由不同的人员尝试。有2个以上果实为辣的单株为辣味单株，3个辣味单株的材料为辣味材料。三、77013a基因组重测序采用pe150，hiseq4000对77013a基因组进行重测序，平均测序深度42x，以cm334(pepper.v.1.55,http://peppergenome.snu.ac.kr/.)为参考基因组，利用samtools软件预测样本中的snp位点。利用primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3)在线设计kaspar引物。四、多态性snp标记的筛选1、kaspar标记本发明所采用的每对kaspar分子标记含有3条引物序列：a1、a2、c。其中，a1、a2仅仅是末端的snp位点存在差异，在a1、a2的5’端分别加有不同荧光标签序列：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(fam荧光标签序列)；5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(hex荧光标签序列)。此两段序列与kaspv4.02xmastermix96/384,lowrox里带有荧光的序列互补，配对后会激发荧光。c为反向互补序列。(1)kaspar标记的pcr扩增体系(4.055μl)：dna模板(5ng·μl-1)2μlkaspv4.02xmastermix96/384,lowrox2μl引物混合液0.055μl其中，kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox为英国lgc公司产品，其产品目录号为kbs-1016-017。kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等组成。荧光探针a的序列为5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b的序列为5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团q；淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团q(2)引物混合液体系(50μl)：引物浓度均为100μmol·l-1c15μla16μla26μl灭菌h2o23μl(3)384孔pcr板扩增，程序如下：(4)pcr产物的检测kasparpcr扩增反应后读数需使用roche480荧光定量仪，进行kaspargenotying，读取荧光数据，若基因分型效果不理想，则需要添加程序：94℃20s，57℃60s，3个循环；37℃1min，再进行数据读取。lgc公司提供了在roche480荧光定量仪上分析的说明书，可从www.lgcgenomics.com获的。x轴为fam(465-510)通道，y轴为hex(533-580)通道。根据分析结果按照如下确定待测基因的具体基因型：聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，左下角显示黑色的样本为以h2o替代模板的空白对照。2、辣椒pun候选基因snp标记的获得及对应kaspar引物的确定设计位于辣椒pun候选基因区间的kaspar引物，利用5个不同的杂交组合进行多态性筛选，结果在辣椒ca02g19240基因区间发现表型与pun基因型一致的kaspar引物组合2_25(引物序列信息见表1，表型及基因型鉴定结果如表2和图1)，可用于辣椒辣味材料的snp分子标记辅助选择。其对应的snp位点具体为辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位点处的核苷酸为a或c。当所述辣椒的表型为“有辣味”，且对应的pun基因型为pun/pun时，该snp位点均为a:a基因型(即辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为a的纯合型)；当所述辣椒的表型为“有辣味”，且对应的pun基因型为pun/pun时，该snp位点均为a:c基因型(即辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为a和c的杂合型)；当所述辣椒的表型为“无辣味”，且对应的pun基因型为pun/pun时，该snp位点均为c:c基因型(即辣椒基因组中对应于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位为c的纯合型)。表1kaspar引物2_25核苷酸序列信息表2分子标记2_25在辣椒双亲及f1代分型情况实施例2、利用本发明标记2_25从自然群体中筛选辣味材料一、试验材料18份辣椒材料(表3)。二、kaspar标记参见实施例1步骤四。三、试验结果结果参见表3和图2，可见：当供试辣椒的表型为“有辣味”(对应的pun基因型为pun/pun)时，分子标记2_25对应的snp位点均为a:a基因型；当供试辣椒的表型为“无辣味”(对应的pun基因型为pun/pun)时，分子标记2_25对应的snp位点均为c:c基因型。因此，可利用本发明标记2_25从自然群体中筛选辣味材料。表3分子标记2_25在辣椒自然群体中的分型情况实施例3、利用本发明标记2_25进行有辣味辣椒和无辣味辣椒(甜椒)杂交后代纯度鉴定一、试验材料1)有辣味母本对照5株(04q-29)；2)辣椒(04q-29)×甜椒(04q-15)杂交种抽样群体88株，分别提取基因组dna。二、表型鉴定田间种植辣椒×甜椒杂交后代株及其母本，常规管理措施进行管理，在成株期依据品种的特征特性逐一进行表型鉴定，标出与母本相似的假f1后代，计算纯度。三、kaspar标记参见实施例1步骤四。四、试验结果苗期表型鉴定在88个单株样本中发现8株为假f1代，纯度为91％。标记2_25分析表明，88个单株样本中8株为母本基因型(图3)。结果表明，本发明标记能够快速地对辣椒×甜椒杂交后代中的母本自交后代进行分子标记辅助鉴别，可用于生产或科研实践中辣椒×甜椒杂交种的纯度鉴定。<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>与辣椒辣味相关的snp标记及其应用<130>gncln171368<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1gaaggtgaccaagttcatgcttcaatcaaacatccagttactcca45<210>2<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gaaggtcggagtcaacggatttcaatcaaacatccagttactccc45<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3aagcaacaaatgtctgaatttgaac25<210>4<211>95<212>dna<213>辣椒（capsicumannuuml.）<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>m为a或c<400>4tcaatcaaacatccagttactccmaaacttggaattaattaggcaataaattcaaagagt60tcctcattgcgttcaaattcagacatttgttgctt95当前第1页12