一株农药残留广谱降解菌株DS3及其生产的菌剂和应用的制作方法

本发明涉及环境污染微生物修复，具体涉及一株农药残留广谱降解菌株ds3及其生产的菌剂和应用。

背景技术：

化学农药作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着非常重要的作用。然而由于人们长期对化学农药的不科学使用，以及化学农药在施用过程中利用率很低，使得化学农药在应用过程中，仅有小部分药剂可以附着于植物上发挥作用，其余大部分散落在大气、土壤和水体等生态环境中。农药使用没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的农药原体，降解物，有毒代谢物和杂质等称为农药残留。残留在环境中，污染了土壤、水体等生态系统中的农药不仅会造成环境污染，而且会通过食物链富集，最终进入人体，严重危害了人类的健康，近年来越来越多的农药残留使人中毒事件发生，造成了极其严重的不良后果。因此，需要进一步研究有关农药残留的降解，来解决农药残留问题。

在当今农药生产中，有机磷农药是其主要类别之一，国内外都在大量生产和广泛使用。目前全球与有机磷农药相关的商品已达到150多种，在我国被广泛应用于农业生产的除草剂、杀虫剂和杀菌剂等有机磷农药约有30种。虽然有机磷农药有效地提高了农作物的产量，但同时由于其大量不合理的使用，使得在蔬菜、瓜果、粮食等农产品和土壤中都发现了有机磷农药残留甚至严重超标的现象。

二苯醚类除草剂是由美国ppg工业公司开发的一类高效除草剂，广泛用于禾谷类作物、玉米、棉花、水稻、大豆和花生田防除阔叶杂草。该类除草剂的作用靶标是杂草的原卟啉原氧化酶，通过抑制其催化的氧化反应导致光依赖的膜脂过氧化，最终造成靶标杂草的死亡。随着二苯醚类除草剂的大量使用，在土壤、地下水及河流中都有残留，对环境生物造成潜在威胁。此外，高剂量的二苯醚类除草剂对人体具有致癌性。

芳氧苯氧丙酸酯类除草剂(aopp)是防除禾本科杂草的一类杂环、含氟、光学活性除草剂。它是由赫司特公司首先开发的，在2，4-滴的基础上进一步优化发展而成。此类除草剂主要作为茎叶处理剂，在中国广泛地用于阔叶作物防除一年生和多年生的禾本科杂草。芳氧苯氧丙酸酯类除草剂被用来控制稻田中禾本科杂草，其大规模使用导致环境中土壤、地下水大量残留。

生物修复是利用生物特别是微生物的生命代谢活动将有机农药降解为无公害的无机物(二氧化碳和水)或其他无害的代谢产物，使受农药污染土壤部分或者完全地恢复到健康状态。它被公认为具有安全、有效、低耗和环保等显著优点，已经成为研究农药修复的热点。生物修复过程中的微生物主要有3种类型：土著微生物、基因工程菌和外来微生物。已报道的能有效降解农药的微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。细菌由于容易诱变和适应性强等特性而在生物修复中占据主导地位。

目前关于鞘脂菌(sphingobiumsp.)农药降解菌株已有一些报道到，但是这些农药降解菌株都是效果单一，一般能降解一种类型的农药，缺乏广谱性，主要集中在单一的有机磷类、酰胺类或者菊酯类农药。例如专利(cn102757915b)一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用，公开了鞘脂菌(sphingobiumsp.)dc-3可以降解乙草胺、丁草胺等酰胺类农药残留；cloningofanovelpyrethroid-hydrolyzingcarboxylesterasegenefromsphingobiumsp.strainjz-1andcharacterizationofthegeneproduct.(appliedenvironmentalmicrobiology,2009,75(17):5496-500)，公开了在sphingobiumsp.jz-1克隆到对菊酯类农药降解的基因。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株农药残留广谱降解菌株ds3，该菌株对于有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留都可以进行有效地降解，具有农药残留广谱降解性。

本发明的另一目的是提供该农药残留广谱降解菌株生产的降解菌剂及其应用；该菌株制备的降解菌剂可在短时间内使土壤或水体环境中残留的有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株农药残留广谱降解菌株ds3，经鉴定为鞘脂菌(sphingobiumsp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年6月5日，保藏编号为cctccno:m2017305。

本发明所述的菌株ds3在降解有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留中的应用。

进一步地，所述菌株ds3可以降解土壤或水体环境中有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留。

所述有机磷类农药包括久效磷、毒死蜱、三唑磷、甲基对硫磷、敌敌畏等。

所述二苯醚类农药包括乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵等。

所述芳氧苯氧羧酸酯类农药包括氰氟草酯、精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯等。

本发明所述的菌株ds3生产的降解菌剂。

本发明所述的降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将降解菌株ds3培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，培养至对数期，制得发酵菌种；

(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的5-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

(3)将种子液按生产罐的培养基体积的5-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵完成后的培养液即为即为降解菌剂。

其中，步骤(2)和步骤(3)所述培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:(1-0.8)，搅拌速度为150-180rpm，培养温度为27-30℃。

其中，步骤(3)所述培养发酵时间为30-48小时。

进一步地，步骤(3)所述发酵完成后的培养液中菌体数量达到10亿个/ml以上。

其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，ph7.2-7.5。

本发明所述的降解菌剂在降解有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留中的应用。

进一步地，所述降解菌剂可以降解土壤或水体环境中有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留。

有益效果：与现有技术相比较，本发明经分离筛选获得农药残留广谱降解菌株ds3可以有效地降解有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留；能将无机盐培养基中的有机磷类如久效磷、二苯醚类如乙羧氟草醚、芳氧苯氧羧酸酯类如氰氟草酯的残留都降解90％以上，同时该菌株制备的降解菌剂能在短时间内降解土壤或水体中高浓度的有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类残留达87％以上，解决残留有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适用于有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留污染的土壤与水体修复；本发明对于保护生态环境，降低农药残留对农作物药害，保护人体的身体健康具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明菌株ds3的菌落照片；

图2为本发明菌株ds3的电镜图；

图3为本发明菌株ds3降解久效磷的hplc分析图谱(a：ck；b：24h处理)；

图4为本发明菌株ds3降解乙羧氟草醚的hplc分析图谱(a：ck；b：24h处理)；

图5为本发明菌株ds3降解氰氟草酯的hplc分析图谱(a：ck；b：24h处理)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

菌株ds3的分离和鉴定：

用来富集降解菌株的富集基质取自上海亚农农药化工有限公司的废水生化处理池的活性污泥，取15g污泥样品置于100ml添加含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的无机盐液体培养基(nh4no31.0g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g，nacl1.0g，水1000ml，ph7.0-7.2)中，30℃、150r/min培养7天，以5％的接种量转接到相同的添加50mg/l乙羧氟草醚的无机盐液体培养基，连续转接4次。通过紫外分光光度计和液相色谱法测定富集液乙羧氟草醚降解效果，获得有降解效果的富集液。取0.5ml有效果的富集液，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释，每个梯度的稀释富集液取100μl涂布在含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的无机盐固体培养基平板上，30℃培养7d。挑取平板上长出的单菌落接种于液体lb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)试管中，30℃、165r/min培养2天，取1mllb培养液，5000rpm离心5min，无菌水洗去lb培养基后，取1ml无菌水重悬菌体，分别接种至加有含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的无机盐液体培养基中，30℃、165r/min培养3d，通过紫外分光光度计和高效液相色谱分别检测三种农药降解效果。对三种农药均有降解效果的菌株即为降解菌株。

紫外分光光度计降解效果的验证方法：采用uv-1700微量紫外分光光度计分别测定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的质量浓度。往待测降解菌液中加入等量体积的二氯甲烷，剧烈振荡5-10min，然后静置直到水相和有机相完全分层，吸取下层水相，保留有机相，下层水相再一次用等体积的二氯甲烷萃取，两次得到的有机相经无水硫酸钠去除残留的水分后，于紫外-可见分光光度计上在波长200-350nm范围内进行扫描。通过乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在200nm-350nm处的特征吸收峰峰值的高低来分别判断降解液中三种农药浓度的高低。

高效液相色谱降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1ml甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用紫外和高效液相色谱分别测定提取液中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的含量，液相色谱条件：流动相已腈：水(50：5，v/v)，zorbaxc218odsspherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，agilent，usa)，柱温为40℃，pda检测器，测定波长230或280nm，进样量10μl，流速为1.0ml·min^-1。外标法按峰面积定量。

从富集液中，通过验证得到1株广高效广谱农药降解菌株，可以降解乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯三种农药，命名为ds3。该菌株16h对100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯降解率都能达到90％以上。如图1所示，菌落ds3在lb固体平板上菌落形态为整体圆形，表面隆起、边缘整齐，湿润、光滑，呈淡黄色，革兰氏染色阴性。菌株ds3电镜图如图2所示，无鞭毛，短杆状(0.3–0.5μm×0.9–1.0μm)。

以菌株ds3的基因组dna为模板，用细菌16srrna基因序列通用引物进行pcr扩增，得到长度为1409bp的16srdna基因序列，如seqidno：1所示。在eztaxon数据库(www.ezbiocloud.net)中进行blast，结果表明菌株ds3与鞘脂菌(sphingobiumsp.)菌株的同源性最近，与菌株sphingobiumyanoikuyaeatcc51230^t和sphingobiumscionensewp01^t同源性都达到98％以上，结合形态和生理生化特征，将菌株ds3初步鉴定为鞘脂菌(sphingobiumsp.)，命名为鞘脂菌ds3(sphingobiumsp.ds3)。将该菌株ds3送交位于中国武汉，中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)保藏，保藏时间为2017年6月5日，保藏编号为cctccno:m2017305。

实施例2

在无机盐培养基中菌株ds3对有机磷类农药残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株ds3对久效磷降解特性测定：挑取ds3单菌落于50mllb液体培养基中，30℃、165r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量达为6×10⁷cfu/ml以上。

在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的久效磷，按3％体积比的接种量接入菌株ds3的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的久效磷，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株ds3种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养24h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株ds3对久效磷的降解情况，并计算降解率，如图3所示，其中a为对照，b为处理。菌株ds3在24h内对久效磷降解率可以达到90％。

采用相同的方法测试毒死蜱、三唑磷、甲基对硫磷、敌敌畏等有机磷农药的降解情况，反应48h后毒死蜱、三唑磷、甲基对硫磷、敌敌畏的降解率都能达到90％以上。

实施例3

在无机盐培养基中菌株ds3对二苯醚类农药残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株ds3对乙羧氟草醚降解特性测定：挑取ds3单菌落于50mllb液体培养基中，30℃、165r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量达为6×10⁷cfu/ml以上。

在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的乙羧氟草醚，按3％体积比的接种量接入菌株ds3的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的乙羧氟草醚，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株ds3种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养24h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株ds3对乙羧氟草醚的降解情况，并计算降解率，如图4所示，其中a为对照，b为处理。菌株ds3在24h内对乙羧氟草醚降解率可以达到92％。

采用相同的方法测试氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵等二苯醚类农药的降解情况，反应48h后氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵的降解率都能达到90％以上。

实施例4

在无机盐培养基中菌株ds3对芳氧苯氧羧酸酯类农药残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株ds3对氰氟草酯降解特性测定：挑取ds3单菌落于50mllb液体培养基中，30℃、165r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量达为6×10⁷cfu/ml以上。

在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的氰氟草酯，按3％体积比的接种量接入菌株ds3的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/l的氰氟草酯，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株ds3种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养24h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株ds3对乙羧氟草醚的降解情况，并计算降解率，如图5所示，其中a为对照，b为处理。菌株ds3在24h内对氰氟草酯降解率可以达到94％。

采用相同的方法测试精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯等芳氧苯氧羧酸酯类农药的降解情况，反应48h后精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯的降解率都能达到90％以上。

实施例5

采用实施例2的方法，在无机盐培养基中加入终浓度均为100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％体积比的接种量接入菌株ds3的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为终浓度均为100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％体积比的接种量接入灭活的菌株ds3种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养48h，通过高效液相色谱法检测菌株ds3对乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯混合农药的降解情况，经过48h培养后发明乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯基本均被降解。

实施例6

菌株ds3的降解菌剂的制备

1)将实施例1分离筛选的降解菌株ds3接种到含3ml的lb(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100ml发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:0.8(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为30℃；制得种子液；

3)将种子液按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为27℃，培养时间为48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。

其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，ph7.2-7.5。

实施例5

菌株ds3的降解菌剂的制备

1)将实施例1分离筛选的降解菌株ds3接种到含3ml的lb(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100ml发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为150rpm，培养温度为30℃；制得种子液；

3)将种子液按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为30℃，培养时间为30小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。

其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，ph7.2-7.5。

实施例6

菌株ds3降解菌剂对土壤中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果测定：

称取多份1000g菜园土作为供试土壤，风干过筛，每份分别加入乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯，使土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯浓度为200mg/kg，按2％的接种量(ml/g)将实施例4制备的ds降解菌剂分别接入到上述土壤中混匀作为处理组1，设相应不加ds3降解菌剂以及加入相同体积灭活lms-cy降解菌剂的含相同浓度农药土壤为对照1组和2组，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，期间土壤的持水量保持在60％，第3天取样分别测定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在土壤中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表1。

表1菌株ds3降解菌剂对土壤中对农药残留的降解效果

由表1可见，使用实施例4制备的菌株ds3降解菌剂，土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯浓度为200mg/kg时降解菌ds3对其的降解率达到88.3％、90.5％和87.5％，并且对照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均没有被降解。结果表明，ds3降解菌剂可有效降解土壤中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯农药残留。同时采用相同方法检测土壤中其他类型的有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留的降解情况，结果与本实施例类似。

实施例7

菌株ds降解菌剂对水体中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果测定：

取多份500ml制药厂废水生化处理池中废水，过滤后，每份分别加入氟草醚、久效磷或氰氟草酯，调整浓度后使水体中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯浓度分别达到为200mg/l，按2％的接种量(体积比)将实施例5制备的ds降解菌剂分别接入到上述水体中混匀作为处理组2，设相应不加ds3降解菌剂以及加入相同体积灭活ds3降解菌剂的水体为对照3组和4组，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，第3天取样测定乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯在水体中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表2。

表2菌株ds3降解菌剂对水体中对农药残留的降解效果

由表2可见，使用实施例5制备的菌株ds3降解菌剂，水体中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯浓度为200mg/kg时降解菌ds3对其的降解率达到89.5％、91.3％和88.7％，并且对照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均没有被降解。结果表明，ds3降解菌剂可有效降解水体中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯农药残留。同时采用相同方法检测水体中其他类型的有机磷类、二苯醚类和芳氧苯氧羧酸酯类农药残留的降解情况，结果与本实施例类似。

针对实施例6和实施例7三种农药同时混合添加在土壤中或者水体中情况，通过调整降解菌剂的接种量和延长反应时间，最终都可以达到全部降解。

sequencelisting

<110>上海市农业科学院

<120>一株农药残留广谱降解菌株ds3及其生产的菌剂和应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<213>sphingobiumsp.ds3

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