本发明属于分子生物学及遗传育种
技术领域：
，具体涉及一种甘蓝型油菜株高性状主效基因位点及与其紧密连锁的两个分子标记，同时还涉及基因位点和分子标记在油菜株型育种中的应用。
背景技术：
：油菜是我国最重要的油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物(hu,2016)，其种植面积和总产都占到全世界的三分之一左右(james,2003)。菜籽油是世界上植物油第二大来源，同时也是我国食用植物油的第一大来源，占到我国国产油料作物产油量的55％以上，在国家食用油供给安全战略中地位十分重要(王汉中,2014)。近年来，我国国产植物油年产量仅维持在900-1000万吨左右，自给率不足40％且有进一步下降的趋势，这对我国食用植物油供给安全造成了重大威胁。在城镇化规模持续扩大、耕地面积进一步缩小的严峻形势下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是主要出路。近年来，我国油菜品种含油量提高较快而单产增加却十分缓慢，这严重影响了农民种植油菜的经济效益和积极性。因此，提高油菜单产已经成为目前我国油菜生产最为迫切的任务之一，是事关我国油菜产业持续与发展的根本问题。油菜单产取决于密度和单株产量。其中，单株产量直接决定于其构成因子，而密度则主要和株型相关。从作物品种的演变历程可以看出，品种改良和产量提高的背后往往伴随着株型的选择和优化，其中株高是一个很重要的方面(沈金雄,2013)。而株高的改良在推动绿色革命中起到了至关重要的作用，其中包括小麦，玉米和水稻等品种中各种矮杆基因的克隆以及功能的研究，而这些基因运用于育种中使得作物产量得到了大幅度的提升(worland,1995；monna,2002；sasaki,2002；sicinski,1995)。大量的实例表明一个或者少数的几个株高基因的克隆很有可能会诱导该品种产量育种的重大突破，但是在油菜中目前还没有株高基因克隆的报道，同时油菜株高的改良可能会引起其产量的革命性增长，因此对油菜株高的研究有着重要的意义。近年来，油菜品种产量徘徊不前(wang,2016)，很多学者提出了理想株型育种的概念(thuling,1991)，成为目前油菜产量取得突破的一个很有希望的方向。因为株高对作物遗传改良的重要性，几十年来研究者们以模式植物拟南芥和重要农作物为研究对象，利用突变体分析和图位克隆等技术手段鉴定了一大批调控植物株高的基因(liu,2007；spray,1996；peng,2014)，虽然在油菜中却没有相关的报道，但是这些克隆出来的与株高有关的基因对于油菜株型改良具有重要的指导意义。油菜株高是一个典型的数量性状，表型连续分布且很容易受到环境条件的影响(王汉中,2014)。近十年来，虽然利用连锁(li,2016；cai,2014)或关联分析(mei,2009；max,2016)的方法，在油菜中已经定位到两百多个株高qtl。这些株高qtl在油菜所有19个连锁群上都有分布，单个qtl能解释的表型变异的范围0-28.6％，其中绝大部分贡献率都比较低，而只在a2、a3、c2和c6连锁群上发现了少数几个效应较大的qtl，c3连锁群上ph13b贡献率为28.6％(mei,2009)，c2连锁群上的贡献率ph12.3为26.5％(udall,2006)，a2连锁群上的ph2.3贡献率为20.8％。但是在油菜中关于株高的基因的克隆目前还没有报道。本发明通过对株高性状qtl的扫描检测以及定位，旨在找到对株高性状具有改良效应的基因位点，用于油菜理想株型育种改良的标记辅助选择。技术实现要素：本发明的目的是在于提供了一种与油菜株高主效qtl位点qphc2(本发明或称为qph.c2)紧密连锁的分子标记引物，所述的qph.c2位点的效应值和对表型变异的解释都超过了以往了报道，对油菜株高的调控起到至关重要的作用，针对该位点找到了两个紧密连锁的ssr标记，ssr标记的引物为：bogms0665-f：tcagagatgaacaagaagca，bogms0665-r：gcgaacctttcccaacct；cnu461-f:ccgaaaccgacctcaacta,cnu461-r:cagtttgagtttcggaatgcac。本发明的另一个目的是在于提供了一种与油菜株高主效qtl位点qph.c2紧密连锁的分子标记引物在油菜育种中的应用。申请人通过利用f2群体衍生的f2:3和f2:4群体进行基因型和表型的鉴定，结果该基因位点被重复检测到，且在该位点附近的标记携带中双11基因型的单株株高性状大多数都低于群体株高均值，这表明该位点来源于中双11并且用于辅助育种选择是切实有效的。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施。主效qtl位点qph.c2的获得：(1)利用中双11和no.73290杂交f1种植后代中挑选基因型杂合的184个单株的f2群体，命名为bnaznf2群体。(2)对bnaznf2群体进行基因型分析，运用在19条染色体中均匀分布的9531个引物，包括6504个ssr引物，2592个snp标记，179个sts标记，76个indel标记，其中1038个引物在连个亲本之间存在了特异多态性，利用这1038个标记导入用joinmap4.0软件中，结果表明其中的803个标记(710个ssr、48个snp、14个sts)紧密连锁。从而构建了一张含803个分子标记的高密度遗传图谱。这803个标记均匀的分布19个连锁群上，19个连锁群的长度从32.1(c7)到148.7(c3)cm，19条连锁群总长1763.2cm，平均每条染色体的长度为92.8cm。(3)对f2群体衍生的f2:3(命名为bnaznf2:3)和f2:4(命名为bnaznf2:4)家系在西宁进行田间试验和油菜株高性状表型鉴定，同时对f2:3和f2:4家系群体进行基因型鉴定，这个过程包括：1)dna的提取；2)利用筛选的803个标记的特异性引物对各个单株进行基因型分析。(4)利用bnaznf2群体的基因型数据和f2:3以及f2:4家系的株高表型数据，采用winqtlcart2.5软件的复合区间作图法进行qtl检测扫描。(5)利用元分析的方法采用biomercator软件对不同环境中检测到的株高qtl进行整合。利用上述方法，申请人最终获得了油菜株高性状相关的主效qtl位点qph.c2，该主效基因位点位于油菜c2染色体上，利用软件winqtlcart2.5软件测得其对油菜株高的贡献率为55.6％，加性效应为-15.98，显性效应为-0.310，该基因位点属于加性遗传。所述的位点与分子标记bogms0665和cnu461紧密连锁，针对这两个分子标记设计引物，如下：bogms0665-f：tcagagatgaacaagaagca，其中bogms0665-r：gcgaacctttcccaacct。cnu461-f:ccgaaaccgacctcaacta,cnu461-r:cagtttgagtttcggaatgcac。一种与油菜株高主效qtl位点qph.c2紧密连锁的分子标记引物在油菜育种中的应用，包括利用本发明提供的引物对待测油菜dna进行检测，可有效地对目的株高油菜进行选择。与现有技术相比，本发明具有以下优点：[1]该位点的贡献率为55.6％，超过了以往所有报道过的甘蓝型油菜株高qtl的贡献率，是目前所报道的qtl中贡献率最大的，前人报道中关于油菜株高qtl的贡献率都比较小，且大多数都不能被重复检测到。[2]该qph.c2位点的加性效应为-15.98，理论上能够改变油菜株高31.96cm的表型。为油菜的作物遗传改良和油菜产量的提升提供了理论基础，同时也是为第二次绿色革命的进行技术储备。[3]本发明中qph.c2位点定位区间为393kb，是目前已报道油菜株高qtl的初步定位物理区间较小的，已经接近精细定位的水平，为后期该位点株高qtl克隆提供了便利。[4]qph.c2位点位于c2染色体上，目前株高qtl在c2染色体上被报道的很少，li(2015)报道的4个关于株高的qtl，且效应值都偏小，其效应值最大的10.51％不能被重复检测到。udall(2006)检测到的株高qtl-ph12.3，其贡献率为26.5％。本发明丰富了关于株高主效qtl的位点分布，为后续对株高基因在油菜染色体上的分布研究提供了的理论支撑。[5]本发明中的qph.c2位点与前人所报道的株高qtl在油菜染色体中的位置均不重叠，是新的株高qtl。[6]目前油菜c2染色体上关于株高的qtl的专利申请还没有一例，本发明可以填补这一空缺，同时为后期油菜理想株型的育种提供技术储备。附图说明图1为bnaznf2:3和bnaznf2:4群体的株高的频率分布；中双11和no.73290所标的位置为该群体中株高均值所处的位置。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：油菜株高性状的主效qtl位点qph.c2的获得：1)本发明采取的分离群体是由亲本中双11号和no.73290衍生的f2以及f2:3和f2:4家系群体。两亲本和f2:3和f2:4两家系群体的株高表型在成熟期收获后经考种鉴定。株高性状考察数据表明：株高性状存在超亲分离现象(图1)。2)利用中双11和no.73290杂交后代中挑选基因型杂合的184个单株的f2(bnaznf2)群体作为分析群体，对bnaznf2群体进行基因型分析，运用在19条染色体中均匀分布的9531个引物，包括6504个ssr引物，2592个snp标记，179个sts标记，76个indel标记，其中1038个引物在连个亲本之间存在了特异多态性，利用这1038个标记导入用joinmap4.0软件中，结果表明其中的803个标记(710个ssr、48个snp、14个sts)紧密连锁。从而构建了一张含803个分子标记的高密度遗传图谱。这803个标记均匀的分布19个连锁群上，19个连锁群的长度从32.1(c7)到148.7(c3)cm，19条连锁群总长1763.2cm，平均每条染色体的长度为92.8cm。3)对f2群体衍生的f2:3(bnaznf2:3)和f2:4(bnaznf2:4)家系在西宁进行田间试验和油菜株高性状表型鉴定，同时对f2:3和f2:4家系群体进行基因型鉴定，这个过程包括：1)dna的提取工作，本研究中采用的是ctab提取叶片总dna，此过程中所用到的试剂包括提取液(1.4mnacl，100mmtris,ph8.0，20mmedta,ph8.0，2％ctab)、氯仿、异戊醇、无水乙醇。2)利用筛选的803个标记的特异性引物对各个单株进行基因型分析。与中双11基因型一致的记作“a”，与no.73290基因型相同的记作“b”，如果含有一个单株同时含有中双11和no.73290的基因型则为杂合基因型记作“h”。4)利用bnaznf2群体构建的连锁图谱和f2:3以及f2:4家系的株高表型数据，用winqtlcart2.5软件的复合区间作图法进行qtl检测扫描，lod阈值采用1000次重复排列测验来确定，基本参数设置，其中步长为1cm；窗口大小为10cm；控制标记数为5；用p＝0.05水平下的lod阈值来确定显著的qtl，为了避免漏掉微效qtl，那些可重复的p＝0.1水平下的qtl也被承认。5)利用元分析的方法采用biomercator软件对不同环境中检测到的株高qtl进行整合。最终在在c2染色体ssr标记bogms0665和cnu461之间检测到了一个重复性很好的株高主效qtl位点，其lod值和贡献率都较大(表1)，针对该分子标记设计引物，引物如表2所示。表1c2连锁群株高主效qtl位点qph.c2的基本信息表2c2连锁群株高主效qtl连锁群bogms0665和cnu461的引物序列bogms0665-ftcagagatgaacaagaagcacbogms0665-rgcgaacctttcccaacctcnu461-fgccgaaaccgacctcaactacnu461-rcagtttgagtttcggaatgcac本发明中的qph.c2位点得贡献率达到了55.6％。同时对前人报道中关于株高qtl进行整合，发现本发明中的qtl对应在油菜染色体图谱上的位置与前人报道均不重叠，即本发明中该主效qtl位点为首次报道，该位点为一个新的qtl。实施例2：ssr标记bogms0665和cnu461有效性的验证根据bogms0665和cnu461标记的基因型来源对f2群体进行分组，挑选非重组单株用于后续的比较分析(表3)。然后，对这些单株对应的f2:3和f2:4群体的株高表型进行统计上的比较分析，确定不同类别之间的差异是否显著。利用亲本中双11和no.73290杂交获得的f1继续种植得f2单株，选取基因型显性杂合的进行f2:3的种植；在f2:3单株定苗前进行挂牌取样，提取叶片总dna，利用ssr标记bogms0665和cnu461对单株进行株高性状主效qtl基因型的分析，根据带型判断基因型，与中双11基因型一致的记作“a”，与no.73290基因型相同的记作“b”，如果含有一个单株同时含有中双11和no.73290的基因型则为杂合基因型记作“h”。统计和中双11、no.73290以及杂合基因型；然后在成熟期收获保留下来的f2:3群体，同时对株高性状进行考察。按上述方法对f2:4群体单株的基因型和表型进行鉴定。表3利用与油菜株高主效qtl位点qph.c2紧密连锁的分子标记引物得到的f2:3和f2:4的株高考种数据分析结果标明，f2:3和f2:4群体中，aa基因型和bb基因型以及hh基因型的单株株高数据的差异达到了显著水平。其中，aa基因型的平均株高比bb基因型的平均株高少30厘米左右，和该位点的加性效值吻合。另外，hh杂合基因型的平均株高十分接近aa和bb基因型株高的均值，再次证明该位点位加性遗传。上述结果充分验证了标记bogms0665和cnu461对株高的有效性，因此其用于株高改良是是切实可行的。因此可以通过对定位区间的缩小来对该基因位点进行克隆进而培育出理想株型株高的油菜品种。sequencelisting<110>中国农业科学院油料作物研究所<120>一种与油菜株高主效qtl位点qphc2紧密连锁的分子标记及应用<130>一种与油菜株高主效qtl位点qphc2紧密连锁的分子标记及应用<160>4<170>patentinversion3.1<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1tcagagatgaacaagaagcac21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2gcgaacctttcccaacct18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gccgaaaccgacctcaacta20<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4cagtttgagtttcggaatgcac22当前第1页12