本发明属于药物制备领域，涉及天然产物异构体的分离制备，具体涉及一种高效、快速制备分离三种人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4的方法。
背景技术：
达玛烷型人参皂苷的c20位多具有羟基，广泛存在于人参属植物，且含量较多。经加热处理后，达玛烷型皂苷及其苷元的c20位羟基易发生脱水反应，形成双键，生成双键异构的系列c20位脱羟基达玛烷型稀有人参皂苷及其苷元。
cn102911238a公开了如下反应式：
但实际上，脱水产物还包括d结构的稀有人参皂苷，其化学式如下：
稀有人参皂苷b、c、d为同分异构体，b与c或d的双键位置不同，c与d为同一位置双键的顺式和反式异构体。这三个同分异构体的极性相似，分离难度大。
cn103193846a公开了一种制备人参皂苷rk3和人参皂苷rh4顺反异构体的方法。人参皂苷rk3和人参皂苷rh4顺反异构体的化学结构式如下：
制备方法包括：(1)硅胶柱层析得人参皂苷rk3和rh4粗品；(2)反相制备液相制备得到人参皂苷rk3与z型rh4的混合品、精制e型人参皂苷rh4；(3)高速逆流分离人参皂苷rk3与z型rh4混合品得精制人参皂苷rk3和精制z型人参皂苷rh4。该申请指出，在大量制备三种化合物的单体纯品时，反相柱色谱无法将人参皂苷rk3与z型rh4有效分离，而高速逆流虽然可以将人参皂苷rk3与z型rh4分开，却无法仅通过高速逆流就将三者分离。
人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4是另一组由达玛烷型皂苷的c20位羟基发生脱水形成的同分异构体稀有皂苷，化学结构式如下：
有研究表明，rg6、z型和e型f4存在不同的药理作用，但是由于标准品获得难度大，无法大量制备，限制了研究者对其活性进一步深入研究。虽然上文提及的cn102911238a公开了一种制备rg6、f4的方法，但是该方法收率低(不到20％)；另外，现有技术也没有公开如何大量(此处大量指单次分离获得三种异构体各100mg以上)分离rg6、z型和e型f4。
总之，大量获得人参皂苷rg6、z型和e型f4标准品的难度较大。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术不足，提供一种高效、快速、大量制备分离人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4的方法；该方法不仅产物得率高，而且可以有效将三种异构体分离，单次分离即可获得三种异构体的质量各在100mg以上。
本发明通过下面的技术方案得以实现：
一种制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的方法，以人参皂苷rg2为原料，以含酸的醇水溶液为反应体系，进行加热脱水反应，创新点在于：以二氧化铅为催化剂进行非均相脱水反应，反应结束后先滤除催化剂再进行浓缩即得。
优选地，所述醇水溶液优选甲醇、乙醇的水溶液，体积百分浓度为40-60％。
优选地，所述酸为甲酸、乙酸，体积百分浓度为0.04-0.06％。
优选地，脱水反应的条件为：反应温度为80-90℃，常压反应时间为2-3小时。
一种以上述混合物为原料分离制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4的方法：采用高速逆流色谱法进行分离制备，并且以乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(体积比4:1:5:0.08)为溶剂系统，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。该溶剂系统中，若不添加乙酸，(z)-f4和(e)-f4无法分开，而且换做甲酸也依然无法分开。
优选地，所述高速逆流色谱法采用多层聚四氟乙烯螺旋管作为分离管，直径2.3mm，分离体积230ml，β值为0.5-0.8。
优选地，高速逆流色谱法的转速为750-850r/min，流动相的流速为1.3-1.5ml/min，分离温度为33-37℃。
优选地，将所述混合物用等体积固定相和流动相组成的混合溶剂溶解作为高速逆流的样品溶液。
优选地，所述固定相、流动相使用前超声30分钟。
本发明的优点：
本发明提供的制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的方法得率高，90％以上的人参皂苷rg2均转化为rg6、(z)-f4和(e)-f4，原料利用率高；本发明提供的高速逆流分离该人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的方法分离效率高，分度度好，可以有效将三种异构体分离，单次分离即可获得三种异构体的质量各在100mg以上。因此，本发明可以用于高效制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4标准品，便于开展药效学研究。
附图说明
图1为高速逆流分离人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。
下述实施例采用的高速逆流色谱仪的相关信息：
gs10a型高速逆流色谱仪(hsccc，北京艾美林科技有限公司)、多层聚四氟乙烯螺旋管(直径2.3mm，分离体积230ml，β值为0.5-0.8)、tbp泵(上海同田生物技术有限公司)、8823b-紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)、3057-11记录仪(重庆川仪总厂有限公司)。
实施例1人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的制备和混合物的分离
混合物的制备方法：
取500mg人参皂苷rg2(自制，纯度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇体积百分浓度为50％)溶解，甲酸添加体积为甲醇水体积的0.05％。溶解后，在反应体系中添加50mg二氧化铅颗粒，85℃热回流反应2.5小时。反应结束后，自然冷却至室温，过滤去除二氧化铅颗粒，滤液浓缩成基本不含甲醇的水溶液，冷冻干燥得到冻干粉。
混合物的高速逆流分离方法：
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(体积比4:1:5:0.08)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。
分别取上相5ml和下相5ml，混合后将上述冻干粉全部溶解在其中(需要超声辅助溶解)作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分离管中(分离温度35±2℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达800r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.4ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为254nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10ml样品溶液注入hsccc仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，色谱图如图1所示。
结果色谱图上主要有三个色谱峰a、b、c，经鉴定，三个色谱峰根据出峰时间依次对应人参皂苷rg6(115.5mg，hplc归一化纯度96.4％)、人参皂苷(z)-f4(123.8mg，hplc归一化纯度95.5％)、人参皂苷(e)-f4(203.5mg，hplc归一化纯度96.9％)。
碳谱结构鉴定：13c-nmr(500mhz，c5d5n)显示，人参皂苷rg6、(z)-f4、(e)-f4的碳谱特征与cn103193846a公布的一致，即：
1、rg6双键在c20和c21之间，c20和c21位于低场，c20和c21化学位移高(c20,δ155.5；c21,δ108.1)；(e)-f4双键位置在c20和c22之间，c20和c22位于低场，c20和c22化学位移高(c20,δ140.1；c22,δ123.6)；(z)-f4双键位置也在c20和c22之间，c20和c22位于低场，c20和c22化学位移高(c20,δ140.1；c22,δ123.5)；
2、(e)-f4相比较(z)-f4，前者c21化学位移较低，约为13ppm；后者c21化学位移较高，约为27ppm。说明e构型由于空间位阻的原因，c21化学位移较低。
实施例2人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的制备和混合物的分离
混合物的制备方法：
取500mg人参皂苷rg2(自制，纯度大于95％)，用200ml含有乙酸的乙醇水溶液(乙醇体积百分浓度为50％)溶解，乙酸添加体积为乙醇水体积的0.05％。溶解后，在反应体系中添加50mg二氧化铅颗粒，85℃热回流反应2.5小时。反应结束后，自然冷却至室温，过滤去除二氧化铅颗粒，滤液浓缩成基本不含乙醇的水溶液，冷冻干燥得到冻干粉。
混合物的高速逆流分离方法：
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(体积比4:1:5:0.08)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。
分别取上相5ml和下相5ml，混合后将上述冻干粉全部溶解在其中(需要超声辅助溶解)作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分离管中(分离温度35±2℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达800r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.4ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为254nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10ml样品溶液注入hsccc仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，色谱图和图1基本一致。
结果色谱图上主要有三个色谱峰a、b、c，经鉴定，三个色谱峰根据出峰时间依次对应人参皂苷rg6(98.5mg，hplc归一化纯度95.2％)、人参皂苷(z)-f4(110.3mg，hplc归一化纯度95.0％)、人参皂苷(e)-f4(194.5mg，hplc归一化纯度95.8％)。
实施例3人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的制备和混合物的分离
混合物的制备方法：
取500mg人参皂苷rg2(自制，纯度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇体积百分浓度为40％)溶解，甲酸添加体积为甲醇水体积的0.06％。溶解后，在反应体系中添加50mg二氧化铅颗粒，80℃热回流反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，过滤去除二氧化铅颗粒，滤液浓缩成基本不含甲醇的水溶液，冷冻干燥得到冻干粉。
混合物的高速逆流分离方法：
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(体积比4:1:5:0.08)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。
分别取上相5ml和下相5ml，混合后将上述冻干粉全部溶解在其中(需要超声辅助溶解)作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分离管中(分离温度35±2℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为254nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10ml样品溶液注入hsccc仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，色谱图和图1基本一致(各色谱峰的保留时间比实施例1滞后约18分钟，峰形基本一致)。
结果色谱图上主要有三个色谱峰a、b、c，经鉴定，三个色谱峰根据出峰时间依次对应人参皂苷rg6(118.5mg，hplc归一化纯度96.5％)、人参皂苷(z)-f4(129.2mg，hplc归一化纯度95.2％)、人参皂苷(e)-f4(214.0mg，hplc归一化纯度95.4％)。
实施例4人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的制备和混合物的分离
混合物的制备方法：
取500mg人参皂苷rg2(自制，纯度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇体积百分浓度为60％)溶解，甲酸添加体积为甲醇水体积的0.04％。溶解后，在反应体系中添加50mg二氧化铅颗粒，90℃热回流反应2小时。反应结束后，自然冷却至室温，过滤去除二氧化铅颗粒，滤液浓缩成基本不含甲醇的水溶液，冷冻干燥得到冻干粉。
混合物的高速逆流分离方法：
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(体积比4:1:5:0.08)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。
分别取上相5ml和下相5ml，混合后将上述冻干粉全部溶解在其中(需要超声辅助溶解)作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分离管中(分离温度35±2℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达850r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.5ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为254nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10ml样品溶液注入hsccc仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，色谱图和图1基本一致(各色谱峰的保留时间比实施例1提前约5分钟，峰形基本一致)。
结果色谱图上主要有三个色谱峰a、b、c，经鉴定，三个色谱峰根据出峰时间依次对应人参皂苷rg6(108.7mg，hplc归一化纯度95.1％)、人参皂苷(z)-f4(117.5mg，hplc归一化纯度95.8％)、人参皂苷(e)-f4(209.3mg，hplc归一化纯度96.1％)。
本发明提供的制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的方法得率高，90％以上的人参皂苷rg2均转化为rg6、(z)-f4和(e)-f4，原料利用率高；本发明提供的高速逆流分离该人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4混合物的方法分离效率高，分度度好，可以有效将三种异构体分离，单次分离即可获得三种异构体的质量各在100mg以上。因此，本发明可以用于高效制备人参皂苷异构体rg6、z型和e型f4标准品，便于开展药效学研究。