一种利用短单链DNA抑制昆虫基因表达的方法与流程

本发明涉及一种利用短单链dna抑制昆虫基因表达的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

同源依赖性基因沉默被广泛应用于分子生物学的研究，主要通过降低转录产物而减少蛋白的合成，从而使其丧失原有的功能。目前用于调控基因表达的同源片段大多数为反义rna与双链rna；随着研究的发现，dna片段的导入也可引起基因的沉默，被称为dna干扰（dnainterference）。

研究指出，将ngago蛋白引入了斑马鱼中，发现注射内源基因的dna片段后，靶标基因的表达会受到抑制，但并不会引起基因突变（qij,dongz,shiy,etal.ngago-basedfabp11ageneknockdowncauseseyedevelopmentaldefectsinzebrafish[j].cellresearch,2016,26(12):1349-1352）；同样的，将原核生物中也存在这一现象（swartsdc,joremm,westraeretal.dna-guideddnainterferencebyaprokaryoticargonaute.nature,2014,507(7491):258），向导dna即可以互补靶标rna而后切割靶标rna（sunghyeoky,taegeunb,kyoungmiketal.dna-dependentrnacleavagebythenatronobacteriumgregoryiargonaute.biorxiv,2017,doi:10.11101/101923），也可以互补靶标dna而切割靶标dna(swartsdc,heggejw,hinojoietal.argonauteofthearchaeonpyrococcusfuriosusisadna-guidednucleasethattargetscognatedna.nucleicacidsresearch,2015,43(10):5120-5129)。

目前，虽然已在部分生物体内发现短单链dna抑制基因表达现象，但是在昆虫中至今还未有报道。因此，我们结合这一现象设计了以下的试验，以求通过短单dna来达到抑制小菜蛾基因的表达。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明公开了一种通过注射短单链dna来抑制昆虫基因表达的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用短单链dna抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：

1）确定昆虫的靶标基因，pcr扩增获得其dna序列并测序；

2）根据步骤1）得到的dna序列，设计短的单链dna片段，送与公司合成；

3）将步骤2）得到的单链dna片段稀释后，利用微量注射的方法注射入昆虫体内；

4）对步骤3）的昆虫进行rt-qpcr的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

步骤1）所述的注射的靶标基因为小菜蛾鞣化激素α亚基基因（该基因mrna的genbank：kj783481）或精氨酸激酶基因（该基因mrna的genbank：hq327310）。

步骤2）中设计的dna片段大小为20-30nt。

步骤3）中的昆虫为福州小菜蛾敏感品系四龄小菜蛾幼虫或福州小菜蛾抗氟虫腈品系。

步骤3）中用到的注射针是利用拉针仪，采用一步法所制得的毛细玻璃注射针。

步骤3）中注射的dna片段每管用无核酸水稀释成0.20-0.45nmol/μl。

步骤4）中rt-qpcr检测的内参基因是核糖体蛋白l8基因或l32基因。

步骤4）中基因的相对表达水平的计算采用2^-δδct或2^-δct方法。

本发明具有以下优点：

1．本发明提供的方法操作简单易行，dna片段容易获得和保存。

2．本发明通过注射dna可有效抑制靶标基因表达。

3．本发明为昆虫基因的抑制提供了思路和方向。

附图说明

图1为本发明具体实施例1注射dna片段后，鞣化激素α亚基基因的相对表达量。相同的字母表示无显著差异，不同字母表示差异显著。

图2为本发明具体实施例2注射dna片段后，精氨酸激酶基因的相对表达量。相同的字母表示无显著差异，不同字母表示差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明，但不限定本发明。下述具体实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述具体实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。pcr所用的taq酶购自厦门泰京生物技术有限公司，rnase-freewater和qpcr反应试剂盒均购自普洛麦格生物技术有限公司，反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，trizol试剂购自ambion公司，dna合成与测序则在铂尚生物公司。

实验方法：

1．dna片段的设计及溶解：选择靶标基因，pcr扩增得到基因全长，并将其送去测序获得基因序列；根据测序得到的dna序列设计注射用的dna片段并送至生物公司合成，将得到的dna片段用无核酸水稀释成0.20-0.45nmol/μl。

2．注射：将针安装至nanoliter2010纳升微量注射泵上，吸取注射液并对实验昆虫进行注射。

3．取样：每隔一段时间，取样一次，将取出的样用液氮保存后待用。

4．基因表达水平检测：提取保存样品的rna，并反转录得到cdna，利用qpcr试剂盒检测目的基因的相对表达量。

实施例1

1．确定小菜蛾鞣化激素α亚基基因为靶标基因，以小菜蛾基因组数据库中的小菜蛾鞣化激素α亚基基因为模板，设计一对引物。

上游引物01f：5＇-gatttaactgtttgtcaaatgca-3＇

上游引物01r：5＇-acactgatcaagagatttattatagt-3＇

用上述引物进行pcr，得到大约750bp（包括部分5’utr和3’utr）的pcr产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于铂尚公司测序，测序结果表明pcr产物的核苷酸序列如seqidno.1所示。

2．根据测序结果在外显子和内含子区域分别设计1条片段（e2和i1，序列如seqidno.2-3），将设计的两条短的单链dna片段（e2和i1）送于铂尚公司合成。将上述合成得到的两条短单链dna片段分别用无核酸水稀释成0.45nmol/μl。

利用拉针仪，采用一步法（一步法温度设置在65℃）将毛细玻璃管制成微量注射针，180℃干燥灭菌2小时。

选取福州小菜蛾敏感品系四龄小菜蛾幼虫为供试虫体。

将已开口并灌入硅油的针安装nanoliter2010纳升微量注射泵，然后利用注射泵的控制装置将硅油打出，之后再吸取注射溶液入注射针中，确定注射针可以工作后，接着一手轻压虫体头部，一手持注射装置将针头从虫体背部接近尾部的地方插入，脚踩控制器两次，注射完成后拔出针头，再对另一只供试虫进行同样的操作，实验中，水与egfp处理对照组组以及其他处理组的注射操作均参照上述的描述。

3．将注射后的虫体按注射的dna片段分别放在不同的盒子内饲养。饲养温度26±1℃，饲养湿度60%-80%，每天供应新鲜的萝卜叶。

注射后的第24小时进行取样，每个处理3次生物学重复，每个重复取5头试虫。所有取出的样品用液氮冷冻后，于-80℃保存待用。

4．用trizol试剂提取样品的rna，再用反转录试剂盒将其反转录得到cdna。根据小菜蛾核糖体蛋白l8基因序列（genbank：xm_011559216）和小菜蛾鞣化激素α亚基基因序列（seqidno.1），分别设计qpcr所需的引物对qrpl8-f/qrpl8-r和qbursα-f/qbursα-r。

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qrpl8-r：5＇-cgtgaggatgctccacagggt-3＇

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用qpcr反应试剂盒检测各样品cdna中鞣化激素α亚基基因和核糖体l8基因的表达情况，然后采用2^-δδct方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。

5．rt-qpcr检测基因表达情况，使用spss软件对数据进行单因素方差分析，结果发现不同处理小菜蛾的鞣化激素α亚基基因表达有显著差异（f=27.65，df1=3，df2=8，p=0.000），其中注射外显子和内含子短单链dna片段，基因表达量都比对照显著下降。

实施例2

1．确定小菜蛾精氨酸激酶基因为目的基因，以小菜蛾基因组数据库中的小菜蛾精氨酸激酶（ak）基因为模板，设计一对引物。

上游引物01f：5＇-gcacttcaggttcaggctcg-3＇

上游引物01r：5＇-ccgaccgcacttccaatacttacc-3＇

用上述引物进行pcr，得到3579bp的pcr产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于铂尚公司测序，测序结果表明pcr产物的核苷酸序列如seqidno.4所示。

2．根据测序结果设计在外显子和内含子区域各设计一条dna片段ak-e2（seqidno.5）和ak-i3（seqidno.6），送于铂尚公司合成。将合成得到的短单链dna片段（ak-e2和ak-i3）分别用无核酸水溶解成0.25nmol/μl的溶液。

利用拉针仪，采用一步法（两步法温度设置在65℃）将毛细玻璃管制成微量注射针，180℃干燥灭菌2小时。

选取福州小菜蛾抗氟虫腈品系三龄小菜蛾幼虫4。

将已开口并灌入硅油的针安装nanoliter2010纳升微量注射泵，然后利用注射泵的控制装置将硅油打出，之后再吸取注射溶液入注射针中，确定注射针可以工作后，接着一手轻压虫体头部，一手持注射装置将针头从虫体末第3-4节间插入，脚踩控制器两次，注射完成后拔出针头，再对另一只供试虫进行同样的操作。对照组为水处理组。

3．根据注射的液体，将注射后的虫体分别放在3个的盒子内饲养。饲养温度26±1℃，饲养湿度60%-80%，每天供应新鲜的萝卜叶。

注射后的第72小时进行取样，每个处理3次生物学重复，每个重复取2头试虫。所有取出的样品用液氮冷冻后，于-80℃保存待用。

4．用trizol试剂提取样品的rna，再用反转录试剂盒将其反转录得到cdna。

根据小菜蛾核糖体蛋白l32基因序列（genbank：nm_001309136）和小菜蛾精氨酸激酶基因序列（seqidno.4），分别设计qpcr所需的引物对rf/rr和akf/akr。

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rr：5＇-ctgggtttacgccagttacg-3＇

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用qpcr反应试剂盒检测各样品cdna中精氨酸激酶基因和核糖体l32基因的表达情况，然后采用2^-δct方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。

5．rt-qpcr分析基因表达情况，可知ak-i3和ak-e2两处理组组精氨酸激酶基因的相对表达水平显著低于水对照组（f=14.381，df1=2，df2=6，p=0.005）。其中ak-e2处理组pxak的相对表达量仅不到水处理组的五分之一，而ak-i3也仅为水的四分之一。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种利用短单链dna抑制昆虫基因表达的方法

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