一种腈水解酶重组表达菌株的构建及其高密度发酵方法与流程

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及采用恶臭假单胞菌通过pcr扩增得到腈水解酶基因，构建无需体外诱导的组成型重组表达体系，并研究其高密度发酵工艺及其在烟酸合成中的应用。

背景技术：

烟酸(nicotinicacid)，化学名为3-吡啶甲酸，又可叫尼克丁酸、维生素b3，对人体正常生长发育具有重要作用，常被应用于医药中间体、染料、发光材料、食品添加剂和动物饲料等生产中。烟酸在机体组织中的氧化还原过程中发挥重要作用，具有促进细胞新陈代谢和扩张血管的功能，能够促进人和动物的生长发育。烟酸作为药品可防治皮肤病和类似的维生素缺乏症，具有扩张血管的作用，用于医治末梢神经痉挛，动脉硬化等病症。烟酸还可作为具有生理和化学活性的精细中间体、医药中间体，用它可以开发一系列高附加值的产品，如烟酸铬、烟酸肌醇酯、ve烟酸酯、2-氯烟酸等。因此对烟酸的研究具有重要的实际应用价值。

最初，烟酸是通过氧化尼古丁制得，后来逐渐发展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等为原料制备；在我国，烟酸生产起步于上个世纪70年代，目前工业生产中主要以3-甲基吡啶为原料，通过氧化反应制备获得烟酸，而其中氧化方法主要分为液相氧化法和气相氧化法，以上方法具有氧化剂价格昂贵，过程复杂，产物难分离，污染高及对生产设备要求也高等缺点。

相比于传统化学法生产烟酸，生物催化法因其反应条件温和，无需在强酸、强碱、高温、高压等苛刻的条件下进行，因而倍受关注。传统的重组菌产腈水解酶多数需进行体外诱导，增加了工艺步骤和生产成本，且iptg对菌体具有一定毒害。构建无需体外诱导的腈水解酶组成型重组表达体系，可避免iptg使用所导致的生产成本增加及对菌体造成的毒害作用。通过高密度发酵制备大量菌体用于生物催化反应，将进一步降低工艺的生产成本，对于工业规模烟酸的生物合成具有重要的研究意义。

技术实现要素：

本发明的目的是构建一种无需进行体外诱导的腈水解酶组成型重组大肠埃希氏菌escherichiacolinit-1，并研究其高密度发酵工艺，最终应用于烟酸的连续转化合成。

本发明采用的技术方案是：一种产组成型重组腈水解酶的大肠埃希氏菌的构建，方法如下：

1)腈水解酶基因nit的扩增：提取恶臭假单胞菌pseudomonasputidacgmcc3830基因组，设计上下游引物2pu和3bd，pcr扩增获得腈水解酶基因nit，引物序列如下：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

2)pet-3b重组质粒的制备：利用限制性内切酶对pet-3b质粒进行双酶切，将同样酶切后的腈水解酶基因nit与pet-3b质粒相连，得到重组质粒pet-3b-nit；

3)重组质粒的转化：将重组质粒pet-3b-nit转入e.colibl21(de3)中，得到重组菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名为大肠埃希氏菌escherichiacolinit-1，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路一号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

本发明还提供所述产组成型重组腈水解酶的cgmccno.14254的高密度发酵方法，具体如下：将斜面菌种进行活化，以2～5％的接种量转接至新鲜的种子培养基中，在30～40℃条件下培养8～16h。按照5～20％接种量转接至发酵罐中，利用ph电极和溶氧电极实时监测发酵液的ph和溶氧值，通过调节转速和通气量，使溶氧维持在10～20％。在分批发酵阶段，流加25％氨水(v/v)使发酵液ph不低于6.8，分批发酵阶段葡萄糖消耗完后进入补料阶段，采用ph-stat补料策略进行发酵，在补料前期，通过流加氨水的调控方式设置ph稳定在6.8，每升高0.01即开始流加补料培养基；补料中期，设置ph每升高0.03即开始流加补料培养基；补料后期设置每升额高0.05开始补料。发酵转速维持在600rpm以内。所述发酵罐内添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，所述发酵培养基组分为(g/l)：胰蛋白胨10～20，酵母粉5～15，nacl0.1～1，kcl0.1～0.5，mgcl20.5～1，葡萄糖5～20，微量元素1～5ml/l(微量元素溶液g/l：fecl3·6h2o6，znso4·7h2o0.58，cacl20.2，cucl2·2h2o0.2，mnso4·h2o0.3，edta0.5)，ph6.0～7.0。所述补料培养基组分为(g/l)：葡萄糖500～1000，mgso410～20，微量元素10～20ml/l。

本发明还提供所述产组成型重组腈水解酶的cgmccno.14254在连续转化合成烟酸中的应用，所述应用为：以重组大肠埃希氏菌经发酵获得的菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在ph7.2的磷酸盐缓冲液中构成转化反应体系，在30℃条件下进行批次转化反应，采用hplc检测转化液中底物残留情况，反应完全后，继续投入下一批次底物。

所述反应体系中底物投料浓度为100～300mm。

所述发酵培养获得的含腈水解酶细胞用量以菌体干重计为1.5～5.0g/l。

本发明所述重组菌cgmccno.14254发酵培养获得的含酶湿菌体的菌体干重测量方法为：测量单位菌浊度、单位体积的菌体细胞干重，得od600与菌体细胞干重的关系曲线，可以获得不同光密度下的菌悬液干重。

本发明所述检测底物3-氰基吡啶和产物烟酸的高效液相色谱条件为：dionex3000型高效液相色谱仪，色谱柱为waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱温30℃，流速为0.5ml/min，紫外检测波长268nm，流动相为乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)等度洗脱。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明首次成功构建了产组成型重组腈水解酶的大肠埃希氏菌cgmccno.14254，该菌株无需进行体外诱导便可高效表达重组腈水解酶，为生物催化合成烟酸提供大量廉价的催化剂；(2)本发明提供了一种产腈水解酶的大肠埃希氏菌cgmccno.14254的高密度发酵方法，该方法采用ph-stat策略进行流加补料，既保证了菌体的快速生长，又避免了菌体过快生长产酸所导致的抑制效应，而且在不同发酵阶段采用不同的调控策略，使腈水解酶对3-氰基吡啶底物的酶活达到目前文献报道的最高水平，为653.84u/ml，菌体最大od600为86.40，分别为分批发酵的14.87倍和6.69倍；(3)本发明将重组大肠埃希氏菌用于生物催化生产烟酸实验，结果表明，该菌可有效生物催化连续生产烟酸，底物3-氰基吡啶投料浓度为200mm(20.8g/l)时，以3.51g/l的静息细胞为催化剂时，平均转化速率为26.97g/h，能在290min内完全转化22批次底物，烟酸累积浓度可达541g/l，因此该菌株在生物催化连续生产烟酸的领域中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为菌体干重与光密度od600之间的关系曲线；

图2为ph-stat补料策略下cgmccno.14254产生重组腈水解酶的发酵过程曲线；

图3为100mm投料底物浓度对连续转化合成烟酸的影响；

图4为200mm投料底物浓度对连续转化合成烟酸的影响；

图5为300mm投料底物浓度对连续转化合成烟酸的影响；

图6为1.50g/l(a)、2.26g/l(b)、3.51g/l(c)和4.57g/l(d)的cgmccno.14254静息细胞进行批次转化反应结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：产组成型重组腈水解酶的大肠埃希氏菌cgmccno.14254的构建

下列实施例中未注明具体分子构建条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人的《分子克隆实验手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

1)腈水解酶基因nit序列的扩增：从恶臭假单胞菌pseudomonasputidacgmcc3830中提取基因组dna，作为模版，设计上下游引物2pu、3bd及酶切位点，进行pcr扩增，引物：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

pcr扩增体系：

pcr反应过程：在95℃预变性3min后开始循环，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；于72℃下终延伸5min；12℃保温获得携带酶切位点的腈水解酶基因nit。

2)重组质粒的制备：利用限制性内切酶对pet-3b质粒进行双酶切，酶切体系设计如下：

经琼脂糖凝胶电泳分析回收获得酶切后的pet-3b质粒。

3)腈水解酶基因与pet-3b质粒的连接：连接酶切后的腈水解酶基因与pet-3b质粒，得到重组质粒pet-3b-nit，连接体系设计如下：

4)重组质粒的转化：将重组质粒pet-3b-nit转入e.colibl21(de3)中得到重组菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名为大肠埃希氏菌escherichiacolinit-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

实施例2：高密度发酵技术在重组腈水解酶发酵中的应用

将斜面菌种cgmccno.14254进行活化，以2％的接种量转接至新鲜的种子培养基中，在37℃条件下培养8h。按照10％接种量转接至发酵罐中，利用ph电极和溶氧电极实时监测发酵液的ph和溶氧值，通过调节转速和通气量，使溶氧维持在10％。从分批发酵阶段开始，通过流加氨水调节ph，使之不低于6.8；在补料阶段，设置ph稳定在6.8，(1)补料前期，ph变动0.01时开始流加补料培养基或氨水；(2)补料中期，ph变动0.03开始流加补料培养基或氨水；(3)补料后期，ph变动0.05即开始流加补料培养基或氨水。定期取样监测分批发酵阶段的残糖浓度，当残糖基本消耗完全时进入补料培养阶段。发酵培养至39h，测得菌体最高od600为86.4，是分批发酵的6.69倍；在发酵45h时，酶活达到最高值，为653.84u/ml，是分批发酵的14.87倍。根据已有资料来看，本研究所产腈水解酶总酶活为目前文献报道的最高水平。

实施例3：游离细胞催化剂的制备及连续转化

将cgmccno.14254于发酵培养基中培养8～10h的发酵液于12000×g离心1min后弃去上清液，再用磷酸钠缓冲液(ph7.2,100mm)重悬菌体并洗涤2～3次，得到除去培养基残液的菌体，最后用相同的磷酸钠缓冲液重悬菌体得到静息细胞悬浮液，测定菌体浓度后保存于4℃冰箱中备用。

将制备的细胞菌悬液(100ml，菌体干重为2.26g/l)与1.04g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为100mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

当投料底物终浓度为100mm时，大肠埃希氏菌游离细胞能够在865min内完全转化34批次底物，其中，在前14次补料中，游离细胞均能够在20min内将底物完全转化，随着投料反应的继续以及产物累积浓度的增加，转化时间逐渐延长，至第34次补料，底物转化时间延长至60min，烟酸终浓度达到418g/l。hplc未检测出任何底物残留，且反应过程无副产物烟酰胺生成，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为10.85g/h。

实施例4：改变投料底物浓度，连续转化合成烟酸

将实施例3制备的菌悬液(100ml，菌体干重为2.26g/l)与2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为200mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

当底物投料浓度为200mm时，转化前期每批次补料的底物均能在20min内完全转化，第11批次补料后，底物转化时间延长至25min，在第17批次补料后，底物转化时间延长至60min。最终，游离细胞能够在410min内完全转化17批次底物，烟酸终浓度约为418g/l。hplc未检测出任何底物残留，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为22.90g/h。

实施例5：改变投料底物浓度，连续转化合成烟酸

将实施例3制备的菌悬液(100ml，菌体干重为2.26g/l)与3.12g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为300mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

按照3-氰基吡啶终浓度300mm的投料量进行批次转化实验，重组菌游离细胞能够在365min内完全转化8批次底物，在前6次补料中，菌体均能够在30min内将底物完全转化，在第8次投料后，底物完全转化时间延长至115min，烟酸终浓度为295g/l。hplc未检测出任何底物残留，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为18.15g/h。

实施例6：改变静息细胞浓度，连续转化合成烟酸

将实施例3制备的菌悬液(100ml，菌体干重为1.50g/l)与2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为200mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

1.50g/l的静息细胞能够在400min内完全转化14批次底物，烟酸浓度达到344g/l，前12批次补料的底物均能在25min内被完全转化，直至第14批次补料后，底物在60min左右才被完全转化。单位大肠埃希氏菌菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为29.12g/h。

实施例7：改变静息细胞浓度，连续转化合成烟酸

将实施例3制备的菌悬液(100ml，菌体干重为3.51g/l)与2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为200mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

3.51g/l的静息细胞能够在290min内完全转化22批次底物，烟酸浓度达到541g/l，前20批次补料的底物均能在10min内被完全转化，至第22批次补料，底物转化时间延长至60min左右，每克菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为26.97g/h。

实施例8：改变静息细胞浓度，连续转化合成烟酸

将实施例3制备的菌悬液(100ml，菌体干重为4.57g/l)与2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为200mm)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过hplc检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，继续投入下一批次的底物。

4.57g/l的静息细胞可在280min内完全转化24批次的底物，烟酸浓度达到了590g/l，在前22次的投料反应当中，每批次投入的底物均能在10min内被完全消耗，至第24批次补料时，底物转化时间延长到30min。每克菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为23.41g/h。

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