技术领域：
：：本发明属于保健品制备
技术领域：
：，涉及一种抗衰老强记忆的花生粕发酵组合物，取纳豆菌为发酵菌种，以花生粕为主要发酵底物，经过提取分离获得富含纳豆激酶、活性多肽、活性多糖以及纳豆菌的发酵产物，再将发酵组合物制备成花生粕保健品，用于中老年人群抗衰老和增强记忆力。
背景技术：
：：：近年来随着社会的发展和人们生活水平的日益提高，人的平均寿命不断延长，老龄人口急剧增加。《中国心血管病报告2015》显示全国每5个死亡人中，就有2个是死于心脑血管病，心脑血管疾病已经成为国民健康的头号杀手。此外，心血管疾病呈现出年轻化的特点，并且趋势越来越明显。面对越来越多的心脑血管疾病患者，应大力提倡预防与治疗相结合的模式。生物活性肽类，具有提高免疫、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血压等作用，可在疾病预防保健方面起到重要的作用，已成为新型功能食品和保健品的开发重点。纳豆，含有独特的纳豆激酶，具有溶血栓、降血压、防治糖尿病等功能，如今纳豆成为一种渐渐被大众所关注的健康食品，如中国专利201410102876.7公布了一种花生粕纳豆酱的制备方法，中国专利201610562331.3公布了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，这种由纳豆芽孢杆菌发酵制得的纳豆激酶(nk激酶)经临床研究已被证实具有溶解血栓的作用，此外，发酵产物中还含有多种的人体必需氨基酸和生物活性肽类，有益人体健康。花生粕经过微生物的发酵作用，可分泌多种蛋白酶，通过酶解作用分解蛋白质，生成有利于肠道吸收的小分子活性物，降低甚至消除花生蛋白中的胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，同时也产生大量益生菌、活性肽、维生素等物质。活性短肽，具有抗氧化作用，同时也具有抑制血管紧张素转换酶(ace)活性，以及降低心脑血管疾病发病率的作用。尤其是在新的社会形式下，对维持和改善育龄期妇女生育能力提出了更高的要求，女性生殖系统的抗衰老研究具有重要价值。nk是一种碱性丝氨酸蛋白酶，其溶栓能力已被证实。肠道菌群目前已成为治疗胃肠道疾病和一些代谢性疾病的重要手段。有研究结果显示，小鼠肠道微生物菌群中厚壁菌门相对丰度的增加，和拟杆菌门的比例下降与肥胖相关，高脂肪摄入能直接影响肠道微生物以及临床疗效。肠道菌群除了能调节生理功能，还能调节心理状态，对人类医学的发展提供了巨大的潜力和可能。一项由美国ucla的研究人员对肠道易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)病人身上关于肠道微生物和大脑结构的最新研究首次揭示了肠道微生物和大脑中涉及加工机体感觉信息的区域相关。研究结果表明大脑产生的信号可以影响肠道微生物的组成，反之，肠道微生物产生的化学物质可以改变人体大脑的结构。纳豆菌为益生菌，可调节肠道菌群，促进有益菌的生长，抑制有害菌繁殖。目前我国每年花生的产量居世界前列，但在我国用于榨油后的花生粕却利用率非常低，主要用作动物的饲料或肥料等，如中国专利201610769282.0公布了一种花生粕发酵处理方法；花生中含有丰富的蛋白质和必需氨基酸，目前对花生粕的研究大多是采用酶类水解，使其中的蛋白质转化为具有抗氧化活性的肽类，如中国专利201310291695.9公布了一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法；目前国内外仅有的部分采用微生物发酵花生粕的也仅仅限于单一底物，并只停留于简单的体外实验，如中国专利201510622446.2公布了一种从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法；另外，中国专利201410102876.7公布了一种花生粕纳豆酱的制备方法，主要步骤为原料的预处理、浸泡、蒸煮、冷却、接种、发酵及产品保存，其特征在于将花生粕、大豆、燕麦这三种具有较高营养价值的食材融合到纳豆的生产工艺中，生产出了一种具有花生风味的纳豆酱，但仅限于满足人们对酱类新品的需求，在保健作用上还有不少欠缺；中国专利201610562331.3公布了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，将纳豆芽孢杆菌接种到斜面培养基上培养至得到发酵种子，后将发酵种子喷洒于发酵培养基中，经发酵、后熟24小时后浸提、离心获得富含纳豆激酶的上清液，但该技术方案未能充分利用花生粕这种廉价易得的原料，在组合物的制备步骤中没有用花生粕发酵提取的营养液与保护剂搅拌混合制得发酵组合物，在纳豆激酶的酶活保存率，发酵组合物在抗衰老，增强记忆力和提高机体免疫力等方面未体现出显著的功效。而本发明以纳豆菌为发酵菌种，以花生粕为主要发酵底物，通过探索最优发酵条件，经过提取分离获得富含纳豆激酶、活性多肽、活性多糖以及纳豆菌的发酵产物，将发酵产物制备成花生粕保健品，经动物实验发现其对d-半乳糖诱导的衰老大鼠有很好的抗氧化、增强记忆力抗衰老的作用，对抗生素诱导的腹泻小鼠的肠道菌群有很好的调节作用。技术实现要素：：本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种花生粕发酵组合物的制备工艺方法，其产品用于抗衰老和增强记忆力的保健品。为了实现上述目的，本发明涉及的制备抗衰老增强记忆力的花生粕发酵组合物的具体工艺步骤为：(1)种子液制备：在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌用接种环挑取出1～2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养24h得到活化后的纳豆芽孢杆菌，再将活化后的纳豆芽孢杆菌在无菌条件下挑取1～2环接种到种子液培养基中，在37℃和160r/min条件下振荡培养18h得发酵种子液备用；(2)原料发酵：将花生粕用清水洗净，按重量加5倍用1mol/l的naoh调成ph10的水浸泡4-6h，清水洗净，然后加3倍用0.01mol/l的naoh调节ph至7.0-7.5的水再浸泡6-8h；再将豆粕、芝麻粕、麸子分别用清水洗净并加总重量3倍的水浸泡10-12h，然后按花生粕：豆粕：芝麻粕：麸子＝70：20：5：5的干品重量比混合，并加入总重量2％的蔗糖、0.8％的硫酸镁和0.8％的氯化钙；混合均匀在120～125℃的温度下处理30min得发酵培养基；然后将发酵培养基自然冷却至60℃以下，在无菌条件下，按接种量6-8％，料水比1:0.3-0.5，温度37℃，进行恒温固态发酵35-40h；在发酵组合物中加入2倍的生理盐水，控温4℃搅拌浸提2h，800r/min离心10min，取上清液；连续提取两次，合并浸提液，获得富含纳豆菌、纳豆激酶、活性多肽、活性多糖和多酚的发酵营养液；(3)组合物制备：将步骤(2)制备的发酵营养液与保护剂搅拌混合后，先放在-20℃提前预冷冻24h，再置于-54℃的真空冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；以纳豆激酶的酶活保存率作为评价指标，考察各种保护剂分别在0％、2％、5％、10％、15％和20％的不同添加重量的条件下对nk活力的保护程度，确定保护剂最佳添加量，并制得发酵组合物原液，所述保护剂包括蔗糖、β-环糊精、麦芽糊精、辛烯基琥珀酸淀粉钠、柠檬酸钠；(4)组合物应用：建立雌性大鼠衰老模型，将60只雌性sd大鼠，按体重随机分组：空白组n(生理盐水)、模型组m(生理盐水)、低剂量组fl(发酵组合物原液25倍稀释液)、高剂量组fh(发酵组合物原液5倍稀释液)和阳性对照组y(ve100mg/kg)，每组12只；除空白组腹腔注射生理盐水外，其余各组均腹腔注射d-半乳糖(400mg/kg.d)，各组按0.2ml/10g.d灌胃剂量；实验至第8周末，处死大鼠，计算脏器指数，并对样本大鼠进行组织学观察和性激素的生化指标测定；结果显示，fl组、fh组的子宫指数与卵巢指数均高于m组，其中fh组显著高于m组(p<0.05)，fl组、fh组血清中e2水平高于m组，fh组与m组差异有统计学意义(p<0.05)，fl组、fh组血清中fsh均低于m组，且fh组与m组有统计学差异(p<0.05)，各处理组血清lh水平均显著低于m组(p<0.05)；表明花生粕发酵组合物具有抗氧化作用，能延缓雌性大鼠生殖系统衰老；按常规的医学原理，推得能够用于人体抗衰老与增强记忆力方面的保健。本发明与现有技术相比，其工艺过程设计合理，原料选择易得，配方组合科学，制备的产品成本低，产品疗效好，营养价值高，应用环境友好。附图说明：图1为本发明涉及的扩充产物电泳图。图2为本发明涉及的门水平上的物种相对丰度柱形图。图3为本发明涉及的属水平上的物种相对丰度柱形图。图4为本发明涉及的实验大鼠的脏器指数图。图5为本发明涉及的大鼠卵巢组织病理切片(he染色，x200)图。图6为本发明涉及的大鼠子宫组织病理切片(he染色，x200)图。图7为本发明涉及的大鼠水迷宫实验结果图。具体实施方式：下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1：本实施例涉及的花生粕发酵组合物的具体制备工艺步骤为：(1)种子液制备：在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌用接种环挑取出1～2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养24h得到活化后的纳豆芽孢杆菌，再将活化后的纳豆芽孢杆菌在无菌条件下挑取1～2环接种到种子液培养基中，在37℃和160r/min条件下振荡培养18h得发酵种子液备用；(2)原料发酵：将花生粕用清水洗净，按重量加5倍用1mol/l的naoh调成ph10的水浸泡4-6h，清水洗净，然后加3倍用0.01mol/l的naoh调节ph至7.0-7.5的水再浸泡6-8h；再将豆粕、芝麻粕、麸子分别用清水洗净并加总重量3倍的水浸泡10-12h，然后按花生粕：豆粕：芝麻粕：麸子＝70：20：5：5的干品重量比混合，并加入总重量2％的蔗糖、0.8％的硫酸镁和0.8％的氯化钙；混合均匀在120～125℃的温度下处理30min得发酵培养基；然后将发酵培养基自然冷却至60℃以下，在无菌条件下，按接种量6-8％，料水比1:0.3-0.5，温度37℃，进行恒温固态发酵35-40h；在发酵组合物中加入2倍的生理盐水，控温4℃搅拌浸提2h，800r/min离心10min，取上清液；连续提取两次，合并浸提液，获得富含纳豆菌、纳豆激酶、活性多肽、活性多糖和多酚的发酵营养液；(3)组合物制备：将步骤(2)制备的发酵营养液与保护剂搅拌混合后，先放在-20℃提前预冷冻24h，再置于-54℃的真空冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；以纳豆激酶的酶活保存率作为评价指标，考察各种保护剂分别在0％、2％、5％、10％、15％和20％的不同添加量的条件下对nk活力的保护程度，确定保护剂最佳添加量，并制得发酵组合物原液，所述保护剂包括蔗糖、β-环糊精、麦芽糊精、辛烯基琥珀酸淀粉钠、柠檬酸钠；(4)组合物应用：建立雌性大鼠衰老模型，将60只雌性sd大鼠，按体重随机分组：空白组n(生理盐水)、模型组m(生理盐水)、低剂量组fl(发酵组合物原液25倍稀释液)、高剂量组fh(发酵组合物原液5倍稀释液)和阳性对照组y(ve100mg/kg)，每组12只；除空白组腹腔注射生理盐水外，其余各组均腹腔注射d-半乳糖(400mg/kg.d)；各组按0.2ml/10g.d灌胃剂量；实验至第8周末，处死大鼠，计算脏器指数，并对样本大鼠进行组织学观察和性激素等的生化指标测定；结果显示，fl组、fh组的子宫指数与卵巢指数均高于m组，其中fh组显著高于m组(p<0.05)。表明花生粕发酵组合物具有抗氧化作用，能延缓雌性大鼠生殖系统衰老；按常规的医学原理，推得能够用于人体抗衰老与增强记忆力方面的保健。实施例2：本实施例涉及花生粕发酵组合物对抗生素诱导腹泻型小鼠肠道菌群的调节作用：将40只昆明小鼠按照体重随机区组分为空白组a(生理盐水)、模型组b(氨苄西林)、自然恢复组c(氨苄西林+生理盐水)和hfy组d(氨苄西林+花生粕发酵液)，除空白组(a)外，各处理组均每天灌胃氨苄西林(剂量按2mg/gbw·d，相当于成人剂量的5倍)，直至各组出现腹泻，造模结束，处死模型组(b)小鼠并在无菌条件下收集肠道内容物，除空白组(a)和自然恢复组(c)灌胃生理盐水外，hfy组(d)灌胃发酵原液，剂量0.2ml/10g.d，连续灌胃5天处死小鼠，无菌条件下收集肠道内容物，依托illuminahiseq2500测序平台，对肠道内容物进行高通量测序，探究肠道内容物中菌群的分类及丰度；图1为本发明涉及的pcr扩增产物电泳图，所有样本经pcr扩增后均合格，均属于a类(pcr产物目的条带大小正确，条带单一且明显，无杂质，总量满足2次或者2次以上建库需要，可进行后续建库；对其中effectivetags进行out聚类，绝大多数的tags有效，可用于后续聚类等分析；如图2物种相对丰度展示：在门的水平上，各组排在前三位的物种为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门，其中拟杆菌门相对含量最高的是b组(79.87％)c组第二(65.90％)，a组第三(58.22％)，d组最少(45.10％)。厚壁菌门各组由高到低的顺序为d、a、c、b。变形菌门相对含量较高的为b组(17.73％)和c组(17.60％)，次之为a组(11.63％)，最少的为d组(6.92％)；在属的水平上，如图3所示，b组除志贺菌属外，其他均呈现较低的水平。d组毛螺菌科nk4a136属和罗斯氏菌均高于其他各组；梭菌属d组高于b组；粪球菌属a、d两组均高于b组；乳杆菌属d组高于a、b两组；肠球菌属d组高于a组；多样性指数的组间差异显示，b组与各组间都存在菌种丰富度的差异(p<0.05)，d组的物种丰富度高于其他三组(p<0.05)；该结果表明花生粕发酵组合物对抗生素诱导腹泻小鼠的肠道菌群有一定的调节作用，可增加腹泻小鼠肠道有益菌的数量，抑制有害菌的生长，增加肠道菌群的丰富度和物种均匀度。实施例3：本实施例涉及通过单因素和利用正交实验取得保护剂配比，本实施例选用的花生粕应为不含黄曲霉毒素的花生粕，但因大多数花生及其制品中都不同程度地含有黄曲霉毒素，黄曲霉毒素具有强烈的致癌、致畸、致突变作用，对人类健康危害极大，黄曲霉毒素大大限制了花生粕的精深加工和综合利用，根据黄曲霉毒素的性质，采用弱碱法破坏黄曲霉毒素，纳豆菌发酵也可以分解破坏黄曲霉毒素，保证产品的安全性；纳豆激酶容易失活，稳定性差，可通过工艺技术提高纳豆激酶的稳定性，通过单因素试验和正交试验得到纳豆激酶冻干保护剂的最佳配比为β-环糊精5％、麦芽糊精10％、辛烯基琥珀酸淀粉钠2％，在最佳组合保护剂条件下，酶活性可达74.2％，优于使用单一保护剂的效果。本实施例涉及实验大鼠的脏器指数：由图4可知，脾脏指数方差分析结果显示4组间差异均无统计学意义(p＞0.05)；m组胸腺指数与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)，本实施例涉及的组合物fl组和fh组胸腺指数均高于m组，但低于n组(p<0.05)；胸腺指数是反映机体免疫系统状况的指标，胸腺指数下降，反映出机体的免疫系统或呈现出加速衰老的趋势，而机体的衰老又将加速免疫器官的衰竭。子宫指数与卵巢指数能间接反映机体生殖系统的机能状况，机体衰老，子宫和卵巢均会出现不同程度的萎缩，生育能力相应下降，m组胸腺指数、子宫指数和卵巢指数与n组相比均有所下降，表明本实施例所使用d-半乳糖建立雌性大鼠衰老模型成功，进一步说明花生粕发酵组合物对雌性大鼠具有延缓衰老的功效。实施例4：本实施例涉及实验大鼠血清中的抗氧化指标：对大鼠血清中的sod值和mda值进行测定，结果如下：m组与n组相比：sod值较低、mda值较高，且差异有统计学意义(p<0.05)；m组与其他组比：fh组的sod较高(p<0.05)、mda值较低(p<0.05)，m组与fl组间sod、mda值，以及体重，均无统计学差异(p>0.05)；本实施例说明花生粕发酵组合物具有体内抗氧化作用。表1d-半乳糖致衰老大鼠的抗氧化指标注：p<0.05，m组与n组比较；bp<0.05，各处理组与m组比较实施例5：本实施例涉及实验大鼠的血清雌激素指标：如表2所示大鼠血清中e2、fsh和lh的水平，m组与n组均有统计学差异(p<0.05)。fl组、fh组血清中e2水平高于m组，fh组与m组差异有统计学意义(p<0.05)，fl组、fh组血清中fsh均低于m组，且fh组与m组有统计学差异(p<0.05)，各处理组血清lh含量均显著低于m组，且有统计学意义(p<0.05)；本实施例说明花生粕发酵组合物能延缓雌性大鼠生殖系统衰老。表2d-半乳糖致衰老大鼠的性激素指标注：ap<0.05，m组与n组比较；bp<0.05，各处理组与m组比较实施例6：本实施例涉及实验大鼠的卵巢和子宫组织学观察：将大鼠麻醉处死后，取卵巢、子宫，经甲醛固定，脱水后切片、染色，于显微镜下观察组织形态；卵巢组织学观察结果如图5所示，m组卵巢可见闭锁卵泡，出现核固缩，细胞形态不规则、松散、卵泡细胞变小且分散，看不到各级卵母细胞，透明带皱缩为不规则的嗜酸性环状物；花生粕发酵组合物各剂量组可看到处于生长期的卵母细胞和黄体，细胞排列较规则，闭锁卵泡较少，皮质和髓质能清晰分辨；子宫组织学观察结果如图6所示，m组：内膜层变薄，子宫内膜呈现萎缩状态，上皮细胞矮小，腺体小且少，分泌物现象较少；花生粕发酵组合物各剂量组较m组子宫内膜更厚，腺细胞也更丰富，有分泌现象，染色质均匀，细胞核大且圆；结果表明花生粕发酵组合物对雌性大鼠具有延缓生殖系统衰老的功效。实施例7：本实施例涉及大鼠水迷宫实验，由morris水迷宫测量空间学习和记忆能力，由图像自动监视和处理系统记录大鼠的逃避潜伏期和跨越平台次数。图7显示：m组与对n组比较，潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少，表明造模成功。其中fh组平均潜伏期最短，穿越平台次数最多，表明随灌胃剂量增加，大鼠的学习记忆能力有一定程度的提高。通过建立d-半乳糖诱导雌鼠衰老模型和抗生素诱导小鼠腹泻模型，对纳豆杆菌固态发酵的花生粕发酵组合物(hfy)的抗衰老作用和调节肠道菌群作用进行了研究；对衰老大鼠进行了血清生化指标、抗氧化指标、性激素水平以及生殖器官的组织学观察；对腹泻小鼠肠道内容物进行了16s高通量测序，得到肠道内容物中物种丰度和物种多样性的结果，得到以下结论：hfy对腹泻小鼠的肠道菌群起到一定的调节作用，能增加有益菌的数量，抑制有害菌的生长，增加肠道菌群的丰富度和物种均匀度，使腹泻小鼠肠道菌群的构成和菌群含量优于自然恢复组甚至是空白对照组；花生粕发酵组合物具有体内抗氧化作用，增强机体免疫力，延缓雌性大鼠生殖系统衰老，提高记忆能力。实施例8：本实施例涉及发酵组合物原液与黑花生仁浓缩液、黑芝麻液组成的混合液对更年期不适症状的防治临床试验。材料：按实施例1处方配比和方法制备的发酵组合物原液，黑花生仁3-5份，黑芝麻6-10份；募集45-55岁女性更年期不适症状志愿者，其中更年期不适症状包括头痛失眠、情绪焦躁、骨质疏松、面或颈部潮红发热等；排除患有严重的心、肝、肾及其他脏器疾病者，以及接受其他临床治疗者，入选30例；方法：将黑花生仁放入不锈钢高压蒸锅内，并加入黑花生仁重量10-15倍的纯净水加热至110-120℃并蒸煮2-3小时至液体呈黑棕色，冷却至15-20℃，经过滤、浓缩后得黑花生仁浓缩液备用；再将黑芝麻控温20℃以下磨制粉碎成细度小于150目的黑芝麻粉末，然后将黑芝麻粉末放入不锈钢容器内并加入总重量2-3倍的纯净水加热至90-100℃并浸煮40-60分钟后，静置1-2小时并自然冷却至15-20℃，用150目的不锈钢过滤网过滤得黑芝麻液备用；将发酵组合物原液、黑花生仁浓缩液、黑芝麻液按照3:1:2的比例充分混合制得混合液；设实验组、对照组1和对照组2，每组分别有志愿者10名；实验组每天服用混合液100毫升；对照组1每天服用白开水替代发酵组合物原液制得的混合液100毫升，其中黑花生浓缩液和黑芝麻液的比例不变；对照组2每天服用白开水100毫升；连续90天，每隔30天分别对更年期不适症状进行记录，结果见表3；表3对更年期不适症状的防治效果由表3可以看出，与对照组1和对照组2相比，本实施例制备的混合液(实验组)对缓解45-55岁女性更年期不适症状有显著的效果。当前第1页12当前第1页12