KRAS作为胰腺癌中生物标志物的用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及kras作为胰腺癌中生物标志物的用途。

背景技术：

胰腺癌是患者存活率最低的肿瘤之一，其5年生存率低于5％。胰腺癌被认为是由于多年积累的体细胞突变所导致的，在疾病的后期伴随有典型的临床表现。很大程度上，由于对驱动疾病进程的体细胞突变的认知有限，往往在治疗前无法准确表征胰腺癌，所以对胰腺癌患者往往缺乏足够的治疗手段。在疾病的进程中，通过生物标志物的鉴定可以更早地获得患者的预后信息，很大程度上可以使得治疗方法得到改进，也可以使得胰腺癌患者的病情得到监控。

游离dna(cell-freedna，cfdna)测序已经被证实是一种具有可行性和灵敏性的可用于肿瘤相关突变和预后的非侵害性鉴定的工具。基于cfdna测序的液体活检已经被证实在诸多临床适应症中具有预后的价值，且近期的报道也支持了cfdna生物标志物的检测可用于诊断胰腺癌的结论。在胰腺癌后期患者中，对具有潜在治疗效用的基因突变进行观测，诊断和术后过程中cfdna的存在被认为与肿瘤标志物的动态和疾病复发相关。cfdna测序提供了一种相当快速的监控胰腺癌疾病进展工具(相比于ct影像快6个月)。所以，在胰腺癌的相关研究中，基于cfdna的生物标志物分析技术的开发是一个热点课题，任何在cfdna变异检测技术的改进均可能可以在现有的标准预后因素的基础上提供一种新的、重要的肿瘤进程信息。尽管已经有了上述所提及的研究报道，cfdna在可切除胰腺癌中的临床应用中依然有很多方面有待研究。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供了kras(kirstenratsarcomaviraloncogene)作为胰腺癌中生物标志物的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供用于检测kras基因或其活性片段中g12v突变的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后。本发明发明人发现，kras基因中的g12v突变与胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后有着密切关系，存在g12v突变的患者明显相较于其他患者具有更差的治疗效果和/或预后。

本发明中，所述用于检测kras基因或其活性片段中g12v突变的物质应该是本领域技术人员公知的，其制备方法亦应该是现有技术。例如，所述物质可以是可以特异性结合kras或其活性片段中的g12v突变密码子的物质，通过检测该物质的特异性结合，即可以检测kras或其活性片段中是否存在g12v突变。在本发明一具体实施方式中，所述物质可以是能够特异性结合存在g12v突变的kras基因的探针。再例如，所述物质可以是能够特异性扩增kras基因的物质和pcr-hrm法可适用的染料，通过对特异性扩增所得的基因片段进行染色并检测染色后的基因片段的链接温度，即可以检测kras或其活性片段中是否存在g12v突变。在本发明一具体实施方式中，所述物质可以是能够特异性扩增kras基因的引物和/或pcr-hrm法可适用的染料。

在本发明一些实施方式中，所述物质具体为用于检测cfdna中kras或其活性片段的物质。在本发明另一些实施方式中，所述物质具体为用于检测血浆样品和/或全血样品中的kras基因或其活性片段中g12v突变的物质。本发明中，用于检测kras基因或其活性片段中g12v突变的物质通常可以是针对cfdna的，cfdna已经被证实是一种具有可行性和灵敏性的可用于肿瘤相关突变和预后的非侵害性鉴定的工具。对于健康的人来说，血液中的cfdna主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。当有很严重的系统性器官损伤打破这种平衡时，大量死亡的细胞会产生大量的cfdna，使得血液中的cfdna含量大大增加，所以对于肿瘤患者cfdna的检测，血液样本是理想的液体活检对象。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒为pcr-hrm法试剂盒或taqman-arms法试剂盒。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒的检测样本为血液样品(例如，血浆样品和/或全血样品)、肿瘤组织或其病理切片提取的dna，所述病理切片优选为石蜡病理切片。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒为pcr-hrm法试剂盒，试剂盒的使用方法包括如下步骤(或者，所述试剂盒用于包括如下步骤的方法)：

1)通过pcr方法特异性扩增kras目的基因片段；

2)对扩增所得的基因片段进行染色；

3)通过hrm(highresolutionmeltinganalysis，高分辨熔解曲线)法分析染色后的基因片段。

本发明中，通过pcr-hrm法检测kras基因外显子中第12密码子g12v热点突变位点的方法应该是已知的，例如，可使用thermofisher公司的meltdoctor^tmhrmreagentkit，meltdoctor^tmhrmmastermix，qiagen公司hrm^tmpcr-等试剂盒，再例如，可使用abihrm等软件对检测结果进行分析，从而确定待分析的基因片段(样本)中是否存在突变型基因。这些试剂盒通常可以包括针对kras基因的特异性引物、染料等，还可以包括dna聚合酶、去rna酶水、dntp(包括dutp)、镁盐等。在本发明一具体实施方式中，pcr的反应体系可以包括2xhrmpcrmastermix缓冲液10μl、20μm引物kras-f1μl、20μm引物kras-r1μl、模板dna1μl、rnase-freewate7μl，pcr的反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃1min，40个循环，hrm的分析条件为95℃熔解10s，60℃1min，从60℃到95℃收集熔解曲线数据，温度上升速率为0.3％，每0.1℃进行一次数据采集，最后50℃冷却。

在本发明一些实施方式中，对扩增所得的基因片段进行染色时所使用的染料通常是饱和染料，这些染料通常能饱和结合于dna双链小沟位置，染料的使用量相对于dsdna通常是相对过量，以使dsdna没有更多位置结合染料。所述染料可以是小分子荧光饱和染料，具体可使用的染料包括但不限于lcgreen、lygreen、greener^tm和syto9等染料。染料可以在pcr反应之前即加入反应体系中，也可以在pcr反应完成后再加入反应体系中。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒为taqman-arms法试剂盒，试剂盒的使用方法包括如下步骤(或者，所述试剂盒用于包括如下步骤的方法)：

1)通过pcr方法特异性扩增kras目的基因片段；

2)使用探针对检测基因片段中是否存在突变。

本发明中，通过taqman-arms定性检测kras基因外显子中第12密码子g12v热点突变位点的方法应该是已知的，例如，可使用人kras基因突变检测试剂盒(taqman-arms法)(为真生物医药科技,国食药监械(准)字2013第3400363号)，从而确定待分析的基因片段(样本)中是否存在突变型基因。这些试剂盒通常可以包括针对kras基因的特异性引物、针对g12v突变位点的探针等，还可以包括dna聚合酶、纯化水、dntp、mgcl2、荧光信号、阳性指控品等。在本发明一具体实施方式中，pcr的反应体系可以包括2xmicrodiagmutationdetectionmix10μl(其组分为0.5μm引物、0.2μm探针0.5mmdntp、5mmmgcl2及纯化水，含荧光信号fam)、样品dna/阳性质控品/无模板对照(纯化水)2μl、dna聚合酶(5u/μl)0.2μl、纯化水7.8μl。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品(例如，血浆样品和/或全血样品等)中kras基因是否存在g12v突变，评估胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后，所述样品优选为术前样品。在本发明另一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突变，评估胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后。本发明发明人通过对源自患者的术前样品(如血浆样品和/或全血样品等)中的cfdna进行检测，以确定kras基因中是否存在g12v突变，从而进一步评估胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后。

在本发明一些实施方式中，所述胰腺癌为可切除性胰腺癌，所述试剂盒用于评估胰腺癌切除后的治疗效果和/或判断胰腺癌切除后的预后。所述可切除性胰腺癌通常指未包绕主要血管(包括腹腔干、肠系膜上动脉、肠系膜上静脉或门静脉)，且未发生远端转移的胰腺癌。

在本发明一些实施方式中，所述评估胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后具体指评估胰腺癌患者的总生存期和/或无进展生存期。所述总生存期(overallsurvival，os)通常指胰腺癌患者自接受胰腺癌肿瘤切除手术至因任何原因引起死亡之间的时间。所述无进展生存期(progression-freeservival，pfs)通常指胰腺癌患者自接受胰腺癌肿瘤切除手术至发现局部或区域进展(localorregionalprogression)之间的时间段，或指胰腺癌患者自接受胰腺癌肿瘤切除手术至发现远端转移(distantmetastase)之间的时间段，或指胰腺癌患者自接受胰腺癌肿瘤切除手术至死亡之间的时间段。

在本发明一些实施方式中，所述胰腺癌为早期胰腺癌。所述早期胰腺癌通常指胰腺癌一期或胰腺癌二期，胰腺癌的分期通常参照nccn指南和ajcc第七版)。

本发明第二方面提供用于检测kras基因或其活性片段中g12v突变的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估对象是否易发预后性较差的胰腺癌。本发明发明人发现，kras基因突变的存在与胰腺癌的发生有着密切的关系，大约90％的胰腺癌伴随有kras基因突变，从而使得kras成为胰腺癌的重要候选生物标志物，此外，kras基因中的g12v突变的存在与胰腺癌的治疗效果和/或判断胰腺癌的预后有着密切关系，存在g12v突变的患者明显相较于其他患者具有更差的治疗效果和/或预后。

在本发明一些实施方式中，所述物质具体为用于检测cfdna中kras基因或其活性片段的物质。在本发明另一些实施方式中，所述物质具体为用于检测血浆样品和/或全血样品中的kras基因或其活性片段中g12v突变的物质。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品(例如，血浆样品和/或全血样品等)中kras基因是否存在g12v突变，评估对象是否易发预后性较差的胰腺癌，所述样品优选为术前样品，优选为评估对象是否易发手术切除后预后性较差的胰腺癌。在本发明另一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突变，评估对象是否易发预后性较差的胰腺癌。

本发明第三方面提供用于检测kras基因或其活性片段中g12v突变的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断胰腺癌。

在本发明一些实施方式中，所述物质具体为用于检测cfdna中kras基因或其活性片段的物质。在本发明另一些实施方式中，所述物质具体为用于检测血浆样品和/或全血样品中的kras基因或其活性片段中g12v突变的物质。

在本发明一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品(例如，血浆样品和/或全血样品等)中kras基因是否存在g12v突变，诊断胰腺癌是否为预后性较差的胰腺癌，所述样品优选为术前样品，优选为诊断胰腺癌是否为手术切除后预后性较差的胰腺癌。在本发明另一些实施方式中，所述试剂盒是根据样品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突变，诊断胰腺癌是否为预后性较差的胰腺癌。

本发明为“上海市级医院新兴前沿技术联合攻关项目”资助项目，编号：shdc12014108，本发明发明人通过ddpcr和/或靶向的高通量测序技术(下一代测序技术，nextgenerationsequencing，ngs)对早期可切除胰腺癌患者进行评估(85名可切除胰腺癌的患者)，以确定cfdna中是否存在kras突变，并进一步研究了早期胰腺癌患者中的术前cfdna中的kras突变的存在与总生存期(overallsurvival)和无进展生存期(progression-freesurvival)之间的关系，发现术前cfdna中kras突变的存在与总生存期和无进展生存期的变短存在显著关联(p分别为0.004和0.041)，由此揭示krascfdna评估的预后价值，并发现了如何基于cfdna的生物标志物的检测帮助提供用于胰腺癌患者临床治疗的信息，从而可以促进胰腺癌的个体化治疗。

附图说明

图1血浆cfdna突变对于可切除胰腺癌患者的总生存期(os)和无进展生存期(pfs)的影响示意图。(a)术前血浆cfdna中kras突变可检出(n＝32，红)和未检出(n＝53，黑)的患者的总生存期。92.5％和63.％的kras突变未检出的患者术后分别存活6个月和12个月，相对来说，53.8％和42.1％的kras突变检出的患者术后分别存活6个月和12个月。(b)术前血浆cfdna中kras突变可检出和未检出的患者的无进展生存期。77.4％和51.4％的术前血浆cfdna中kras突变未检出的患者术后分别存活6个月和12个月，相对而言，50.0％和32.1％的术前血浆cfdna中kras突变检出的患者术后分别存活6个月和12个月。

图2kras突变检测中ngs的灵敏度和特异性(与ddpcr相比)示意图：对40例血浆cfdna样品进行kras多重ddpcr，40例样本中的28例通过fireflyngs进行测序。三个具有各自等位基因频率的样本(基于ddpcr的结果分别为～0.1％，1％，40％)被用于ngs平行反应。将自ddpcr方法获得的kras等位基因频率与ngs方法获得的等位基因频率进行比较。只有12个样品在ddpcr中被划分为阳性(大于3个事件，n＝12，r2＝0.97)。三个重复样品数据组被标记为亮灰色。即使等位基因频率～0.1％，kras突变仍确实地重复，从而显示出高检测灵敏度。16个样品中未发现假阳性，从而显示出高检测特异性。

图3krasg12v与其他kras突变和kras未突变相比预后示意图。具有krasg12v突变的患者(n＝8，红色)的总生存期(a)和无进展生存期(b)与未检出kras突变的患者相比(n＝53，黑色)，显著变短。除g12v以外的kras突变的患者(n＝24)的总生存期(c)和无进展生存期(d)与kras突变患者(n＝53)相比，没有显著区别。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例中所提及的85位胰腺癌患者均在中国上海长海医院进行招募，招募时间为在2014年8月至2015年6月之间，患者被诊断为患有可切除性胰腺癌，大多数患者(65，76.5％)为癌症二期，患者群体的平均年龄为62.7岁，男性比例为(56，65.9％)，所有患者均接受肿瘤切除手术，同时接受或未接受化疗(所有患者均收到辅助性化疗的处方，但只有43位患者(50.6％)接受辅助性化疗)(患者的详细信息见表1)。所有患者均填写了知情同意书以同意使用他们的临床数据，研究严格依照赫尔辛基宣言进行操作，且同时经长海医院伦理审查委员会批准。

表1

缩写：癌胚抗原，cea,carcinoembryonicantigen；糖抗原19-9，ca-19-9,carbohydrateantigen19-9；循环肿瘤脱氧核糖核酸，ctdna,circulatingtumordeoxyribonucleicacid.

实施例1

1.样品收集

术前静脉血收集采用乙二胺四乙酸试管(vacutainer血液收集试管，美国bd公司)，样品在室温条件下被送至安可济生物科技有限公司(中国上海)进行血浆分离。所有85位患者均进行了10ml全血样本采集。用于获取血浆和白血细胞(whitebloodcell，wbc)样本的血样于手术当天进行抽取。cfdna测序结果并不提供给患者，治疗决策也不根据cfdna的结果进行制定。

2.cfdna和基因组dna(genomicdna)的提取

外周血(每个样品10ml)离心，离心条件为4℃，1600g，10分钟。收集血浆和血沉棕黄层(白血细胞层)，并于-70℃保存。使用qiaamp循环核酸试剂盒(qiagen)自3-5ml血浆中提取cfdna。使用qiaampdna血液maxi试剂盒(qiagen)自白血细胞中提取gdna(genomicdna)。所有dna的提取均参照试剂盒供应商的说明书进行操作，通过qubit荧光计(生命科技公司,carlsbad,ca)定量，并于-20℃下保存至被使用。

3.微滴数字聚合酶链反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddpcr)

使用qx200系统(bio-rad公司)进行ddpcr试验。使用多个用于ddpcr的kras产品(ddpcr^tmkrasg12/g13screeningkit#1863506,bio-rad公司)，，其中包括7个kras突变(g12a，g12c，g12d，g12r，g12s，g12v和g13d)。ddpcr的反应体系为20ul，其中包括4-80ngcfdna(以体积计加入8ulcfdna，不足部分nuclease-freewater补至8ul)，探针fam和hex分别用于检测突变和野生型kras等位基因。

2xddpcrsupermixforprobes(nodutp)10μl

20xtargetprimers/probe(fam)1μl

20xtargetprimers/probe(hex)1μl

将该体系连同70μl微滴发生油分别置入微滴发生器的样本孔与油滴孔中生成8*20000个油包水微滴，将微滴转移至96孔pcr反应板中并密封，以减少交叉污染，随后乳化pcr反应在96孔板上进行，采用mj循环变温加热器(bio-rad公司)，使用时，参照供应商的说明书进行操作。将96孔pcr反应板转移至微滴分析仪(qx200^tmdropletreader,bio-rad)，使用qx200微滴读取器(bio-rad公司)对孔板读取检测结果，使用quantasoft软件(1.4.0版本，bio-rad公司)对孔板上野生型kras和/或kras突变显阳性的微滴的数量进行评估。对随机选择的40位胰腺癌患者ddpcr血浆中的cfdna进行数字pcr分析。一份不含有血浆cfdna的样品作为阴性对照。以3个阳性微滴(3-positive-event)作为kras突变的检出标准。该标准由软件自动统计给出。在40个血浆cfdna样品中，使用多重ddpcr筛选kras突变。可检出kras突变的样品(n＝12)和未检出kras突变的样品sampleswithoutkras(n＝16)均通过以下胰腺癌研究平台进行测序。

4.高通量测序(next-generationsequencing，ngs)和体细胞突变的鉴定

具体方法可参照：xu,ting,etal."cross-platformcomparisonoffourleadingtechnologiesfordetectingegfrmutationsincirculatingtumordnafromnon-smallcelllungcarcinomapatientplasma."theranostics7.6(2017):1437.

基于高通量测序的cfdna评估在firefly平台(安可济生物科技有限公司)上进行。使用含有与胰腺癌相关的50个基因的所有外显子(详见表2)的面板进行捕获。白血细胞和cfdna测序均在胰腺癌研究平台上进行，ngs文库在hi-seq2500(illumina公司)上进行测序，探针的平均覆盖深度约为7000x，测序结果与hg19/grch37人参考序列进行比对，由随机ngs错误造成的本底噪声被去除，随后就可以识别出真正的变体，通过将包含变体的独有测序结果的数量与用于映射变体位置的所有测序结果的数量进行对比，以计算等位基因频率。种系变体通过白血细胞测序确定，并在总的cfdna变体中移除种系变体以确定体细胞突变。32位患者被发现cfdna中存在kras突变，53位患者的血浆cfdna中不存在kras突变。

表2

我们在ddpcr和ngs之间比较kras等位基因频率，并验证了通过ddpcr和ngs技术平台对kras进行检测的结果整体上是相同的。对于ddpcr检测中的阴性子群(小于3个阳性事件)，ngs并未检出假阳性，可见，基于ngs的kras检测具有100％的特异性。对于ddpcr检测中的阳性子群(大于等于3个阳性事件)，ddpcr中未进行扩增的cfdna和ngs报告之间，等位基因频率具有很高的一致性(r²＝0.97，图2)。在等位基因频率为0.01％,0.59％and60％的三个样品中(通过ddpcr确定)，重复ngs检测。平行样品通过ngs检测所得的等位基因频率检测结果分别为0.08％/0.09％，0.83％/1％，和45％/50％(图2)。这些结果验证了基于ngs的平台的可靠性和准确性。

5.统计学分析

cox回归分析与费希尔精确检验被用于与患者结果相关的数据分析。使用kaplan-meier法生成总生存期的曲线和无进展生存期的曲线，并通过时序检验进行对比。单变量和多变量cox回归分析被用于评估预后因素对于总生存期无进展生存期的影响。p值低于0.05被认为统计学上具有显著意义。使用windowsspss20.0和r统计软件包(v3.1.1，http://www.r-project.org/)进行统计学分析。

6.kras突变和病人结果估量之间的联系

总生存期(overallsurvival，os)，总生存期通常指从手术至患者死亡之间的时间段，或者从手术至2015年11月最后一次随访之间的时间段，或从手术至术后研究14个月的时间段。

无进展生存期(progression-freesurvival，pfs)，无进展生存期通常指从手术至发现局部或区域进展(localorregionalprogression)之间的时间段，或从手术至发现远处转移(distantmetastase)之间的时间段，或从手术至死亡之间的时间段。

我们检测了术前cfdna样品中存在kras突变和疾病进程之间的联系。术前cfdnakras突变检出的患者(n＝32)和未检出kras突变的患者(n＝53)进行对比可发现，总生存期l(p＝0.004，图1a)和无进展生存期(p＝0.041，图1b)均有显著性差异。kras阳性和kras阴性的患者，术后6个月的总生存期分别为53.8％和92.5％，kras阳性和kras阴性的患者，术后6个月的无进展生存期分别为50.0％和77.4％。

32位存在kras突变的患者中，相对于那些未检出kras突变的患者(n＝53)，具有krasg12v变体型(n＝8)的患者的总生存期(p<0.0001)和无进展生存期(p＝0.007)显著变短(图3a和3b)。具有其他kras变体型的患者(n＝24)(g12a，g12c，g12d，g12r，g12s和g13d)(图3c和3d)则未发现与其他患者类似的联系。

7.影响生存率的因素

我们随后对如下患者特征进行了研究：年龄、性别、癌胚抗原(cea)、糖康源(ca19-9)、肿瘤大小、肿瘤分期、肿瘤位置、在淋巴结中存在、辅助性化疗的使用、以及kras突变，从而确定他们是否是影响总生存期和无进展生存期的可能风险因素。单变量分析显示辅助性化疗(危害比(hazardratio，hr)，0.46，95％；置信区间(confidenceinterval，ci)0.236–0.890，p＝0.02)、cfdna中存在kras突变(hr,2.513,95％；ci1.313-4.810,p＝0.0006)是总生存期的风险因素(表2)。通过多变量分析，这些因素对于总生存期同样被确认为是显著因素：辅助性化疗(hr，0.413，95％；ci0.211–0.808，p＝0.01)，cfdna中存在kras突变(hr，2.769，95％；ci1.439–5.326，p＝0.002)(表2)。单变量分析显示辅助性化疗(危害比(hr)，0.509，95％；置信区间(ci)0.284–0.911，p＝0.021)、cfdna中存在kras突变(hr，1.806，95％；ci1.016-3.210，p＝0.047)是无进展生存期的风险因素。通过多变量分析，这些因素对于无进展生存期同样被确认为是显著因素：辅助性化疗(hr，0.021，95％；ci0.266–0.861，p＝0.014)，cfdna中存在kras突变(hr，1.939，95％；ci1.087–3.458，p＝0.025)(表3)。

表3

胰腺癌发展过程中，kras突变不仅很早就会出现，而且kras突变也是普遍存在的，患者中的发生率为75％-95％。根据kinguasaetal.报道，cfdna中kras突变可检出的四期患者的中位生存时间(mediansurvivaltime，mst)相较于野生型显得大大变短。而通过上述实验可知，对于已经接受临床切除手术的早期胰腺癌患者，术前cfdna可检出率与癌症复发和死亡密切相关。在复发的患者中，通过cfdna检出的方法诊断复发比ct影响的方法早六个月以上，进一步支持了cfdna循环的存在可能可以作为胰腺癌早期诊断的一种标志物。术前检出cfdna中存在体细胞突变与早期胰腺癌患者(一期和二期)的低总生存期和低无进展生存期之间存在密切关系。具体来说，我们发现，kras阳性和kras阴性的患者在术后6个月的总生存期分别为53.8％和92.5％，cfdna中kras突变可检出的胰腺癌早期患者的总生存期(中值，10.30,95％；ci，6.8-13.3)和无发展生存期(中值，6.30,95％；ci，5.2-na)相对于kras野生型患者的总生存期(中值，>14，95％；ci，na)和无发展生存期(中值，>14,95％；ci，na)来说，总生存期和无发展生存期更短(图1)。这是首次在胰腺癌早期患者(一期和二期)中对术前cfdna的预后价值进行研究，且我们的研究结果与之前支持癌症预后中cfdna检测重要性的报道一致。此外，发明人进一步对6个kras突变((g12a，g12d，g12r，g12s，g12v和q61r))进行充分地研究。在kras突变可检出的患者中，相对于那些存在其他变体型组合的患者，那些只存在g12v变体型的患者明显更差。我们发现，g12v的可检出与患者最差表现密切相关(总生存期，中值7.0，95％；ci，2.015-12.240；无进展生存期，中值5.4，95％；ci，1.8-7.1)(图3)。将我们的发现与前期研究结合可发现，由于我们验证了术前cfdna中kras突变的存在与胰腺癌早期患者的总生存期和无进展生存期的缩短密切相关，所以kras有希望作为可切除胰腺癌患者的生物标志物，作为癌症进程的预后预测因子。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。