通过高通量测序快速检测阿托伐他汀钙的敏感性的方法与流程

文档序号:11246462来源:国知局

本发明涉及一种快速检测阿托伐他汀钙的敏感性的方法,尤其涉及一种通过高通量测序快速检测阿托伐他汀钙的敏感性的方法。



背景技术:

他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂。这类药物抑制肝脏胆固醇合成限速酶,减少低密度脂蛋白、胆固醇的合成,上调肝脏ldl受体基因表达。他汀类药物不仅降低低密度脂蛋白、胆固醇,还具有独立于调脂作用之外的非调脂作用。他汀类药物具有抗炎、改善内皮细胞功能、延缓粥样硬化斑块的破裂、抑制心室重构等降脂外作用稳定斑块,从而有效地降低冠脉事件的发生。阿托伐他汀钙自临床应用20余年以来,在全球大部分国家得到了广泛应用。阿托伐他汀钙((3s,5s)-7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯基氨基甲酰基)-5-异丙基吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸)是比较新型的他汀类药物,其体内代谢产物竞争性抑制hmg-coa还原酶从而起到降低tc、ldl-c、apob和tg水平,改善血脂的作用。多年来的临床观察和科学研究表明,不同人群对阿托伐他汀钙的药效反应不尽相同。除了个体遗传因素差异以外,肠道微生物是最为重要的影响因素。已有研究表明,肠道微生物代谢产生的胆汁酸类物质和阿托伐他汀钙药物共用肝脏和肠道转运载体,在吸收上存在竞争抑制关系。因此,对于肠道菌群中产生胆汁酸类物质的细菌类群较多的患者,阿托伐他汀钙的药效就会受到影响。虽然目前对于肠道微生物如何影响阿伐他汀钙药效的机理已经比较明晰,但是还没有可行的手段在给药前对患者肠道菌群类型是否会产生较多的胆汁酸类进行检测判断,无法预判阿托伐他汀钙在个体上的使用效果,因此需要一种能通过患者粪便快速检测阿托伐他汀钙的敏感性的方法。



技术实现要素:

为了解决上述技术所存在的不足之处,本发明提供了一种通过高通量测序快速检测阿托伐他汀钙的敏感性的方法。

为了解决以上技术问题,本发明采用的技术方案是:

本发明利用还原性物质半胱氨酸,保护粪便样品表面的严格厌氧微生物,提高了后续dna数据采集的完整性,便于实际应用,检测准确率高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

a、样品处理:

取高血脂患者新鲜粪便样品3-5g,置于容量为10ml的离心管中,加入1ml1-10%的半胱氨酸溶液,涡旋震荡3-5min后进行4-10℃冷藏保存,在0-3小时内进行dna提取。优选半胱氨酸溶液浓度5%,涡旋震荡4min,4℃冷藏,2小时内提取dna)。

b、基因组dna的提取:粪便微生物的基因组dna采用qlaampdnastoolminikit(qiagen粪便dna快速提取试剂盒)进行提取,基因组dna的完整性用1%琼脂糖凝胶电泳检测,浓度和纯度用qubitdsdnahsassaykits(qubit核酸定量试剂盒)或者nanodrop分光光度计进行检测。优选qubitdsdnahsassaykits进行定量与纯度检测。

c、16srrna基因测序文库的构建及高通量测序:

利用引物341f和806r或者515f和907r对样品总的16srrna基因的v3-v4区片段进行扩增,反应体系dna模板浓度80-150ng/μl,反应程序循环次数为27-32,pcr产物经纯化后连接上测序接头,从而构建16srrna基因测序文库;采用illuminahiseq2500测序平台对样品中16srrna基因进行高通量双端测序,采用pe250测序策略,测序长度为250bp×2。优选引物对341f和806r、dna模板浓度100ng/μl、反应循环次数27。

d、序列拼接及数据处理:

采用velevt1.2.10拼接,将测序片段进行k-mers长度的重叠拆分,设置k-mers参数值为10,通过组装算法dbg(debruijngraph)将各小片段组装起来;不进行带polya尾的序列标签(tags)过滤,嵌合体筛查采用usearch6.1.544软件包;序列进行操作分类单元(otu)聚类分析,以序列相似度97-98.5%为otu分型界限,忽略数量在1000以下的otu单元,计算属水平各个细菌类群的丰度数据,以反映样品中微生物的结构组成。优选out分类界限为序列相似度98%。

e、通过模型-多项式回归模型计算药敏性预测值p:

p=ax1.2+b(xy)2+cy+dz;

其中,a、b、c、d为常数,x为肠杆菌属细菌相对含量(百分比,下同),y为拟杆菌属细菌相对含量,z为乳酸杆菌属细菌相对含量;

a取值范围为150-300(最优187),b取值80000-140000(最优126800),c取值40-70(最优55),d取值-240至-260(最优-252);

f、根据p值预判患者药敏程度:

p值低于5,患者对阿伐他汀药物不敏感,不建议使用他汀;p值介于5-8,患者对阿伐他汀敏感性属中等水平,可根据实际情况给药;p值高于8,患者对阿伐他汀钙比较敏感,可优先使用阿托伐他汀钙。

实施例1:

威海市立医院,王翔,男67岁,高血脂患者,病史8年:

一、将其晨便进行收集采样,取湿重5g置于10ml离心管,注入1ml5%半胱氨酸溶液,密闭存放于4℃冷藏冰箱。1小时后用qlaampdnastoolminikit粪便试剂盒进行dna提取。提取后的dna用rnase处理30min去除残留rna,用蛋白酶k处理20min去除rnase,然后进行割胶纯化,要求条带单一、清晰,无明显拖尾和弥散。

二、按照步骤一获得dna样本后,将样本利用引物341f和806r或者515f和907r在illuminahiseq2500测序平台对dna样本进行高通量paired-endpe250测序。所得reads数据拼接采用velvet,dbg算法,k-mers值取10,不进行tags过滤,嵌合体筛查采用usearch6.1.544包。序列进行otu聚类,以序列相似度98%为界限进行otu聚类,忽略数量在1000以下的otu单元,计算属水平各个细菌类群的丰度数据。

三、依据步骤一和二中的方法获得某患者的肠道菌群数据后,计算得到肠杆菌属细菌占x=9.1%,拟杆菌属细菌占y=5.6%,乳酸杆菌属占z=4.8%,代入公式:

p=187x1.2+126800(xy)2+55y-252z=10.54+3.29+3.08-12.1=4.81

p值小于5,不建议患者使用阿托伐他汀钙。

实施例2:

威海市立医院,李采梅,女72岁,高血脂患者,病史6年:

一、将其晨便进行收集采样,取湿重3g置于10ml离心管,注入1ml10%半胱氨酸溶液,密闭存放于4℃冷藏冰箱。2小时后用qlaampdnastoolminikit粪便试剂盒进行dna提取。提取后的dna用rnase处理30min去除残留rna,用蛋白酶k处理20min去除rnase,然后进行割胶纯化,要求条带单一、清晰,无明显拖尾和弥散。

二、按照步骤一获得dna样本后,将样本利用引物341f和806r或者515f和907r在illuminahiseq2500测序平台对dna样本进行高通量paired-endpe250测序。所得reads数据拼接采用velvet,dbg算法,k-mers值取10,不进行tags过滤,嵌合体筛查采用usearch6.1.544包。序列进行otu聚类,以序列相似度98%为界限进行otu聚类,忽略数量在1000以下的otu单元,计算属水平各个细菌类群的丰度数据。

三、依据步骤一和二中的方法获得某患者的肠道菌群数据后,计算得到肠杆菌属细菌占x=6.6%,拟杆菌属细菌占y=7.3%,乳酸杆菌属占z=1.7%,代入公式:

p=187x1.2+126800(xy)2+55y-252z=7.17+2.94+4.02-4.28=9.85

p值大于8,建议患者使用阿托伐他汀钙。

上述实施方式并非是对本发明的限制,本发明也并不仅限于上述举例,本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换,也均属于本发明的保护范围。

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