miRNA、组合物及其在诊断疾病中的应用的制作方法

本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及mirna、组合物及其在诊断疾病中的应用，更具体的涉及mir-942-5p、mir-1262及他们的组合物在诊断心肌梗死中的应用。

背景技术：

近期研究表明，mirna参与30％-50％基因的转录和表达调控，在心血管系统的生理和病理机制中都发挥非常重要的作用。现有报道显示mirna参与了心血管重塑的不同病理过程中，包括心肌肥大、纤维化、心肌功能改变以及血管新生等，由于mirna的变化早于基因和蛋白的改变，亦早于疾病症状的出现，由此检测mirna的动态变化，有可能为疾病的发生、发展提供线索，进而指导临床早期干预，有效控制疾病发展。急性心肌梗死(ami)是最严重的一种心血管疾病，早期、准确的诊断可以保证再灌注治疗的立即开始可能减少死亡率。一些生物标志物如心肌肌钙蛋白i已应用与诊断ami，可提高目前诊断，为急性心肌梗死的新方法。以往的研究表明mir-30a是与心肌肥厚相关，可作为诊断急性心肌梗死生物标志物的潜在临床价值，但是这些还远远不够，临床的精准诊断和治疗需要更多候选分子标志物。

本发明基于高通量测序方法，获得心肌梗死mirna的表达数据，同时，结合geo数据库中心肌梗死相关mirna数据，进行生物信息学分析验证，从候选的mirna中挑选出mir-942-5p和mir-1262进行分子生物学验证，结果显示，mir-942-5p和mir-1262与心肌梗死密切相关。可单独或合并用于心肌梗死的临床诊断及预防检测，为临床上相关诊断试剂研发奠定基础。

技术实现要素：

检测mirna的制剂在制备诊断心肌梗死试剂中的应用，所述mirna选自下列中的一种或几种：mir-942-5p、mir-1262。

所述mir-942-5p的序列见序列表seqidno1。

所述mir-1262的序列见序列表seqidno2。

优选的，联合检测mir-942-5p和mir-1262的制剂在制备诊断心肌梗死试剂中的应用。

进一步，诊断心肌梗死试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测样本中mir-942-5p和/或mir-1262。

优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中mir-942-5p和/或mir-1262的转录。

所述的样本为外周血。

进一步，样本中mir-942-5p和/或mir-1262高表达显示患心肌梗死风险增加。

优选的，基于定量pcr方法包括特异性扩增mir-942-5p和/或mir-1262的引物，进一步优选，特异性扩增mir-942-5p的引物序列为seqidno3，特异性扩增mir-1262的引物序列为seqidno4；基于探针杂交方法包括与mir-942-5p和/或mir-1262的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述mirna为mir-942-5p和/或mir-1262的前体，前体序列为seqidno5和seqidno6。

本发明的目的在于提供下调mir-942-5p和/或mir-1262的转录和/或抑制mir-942-5p和/或mir-1262的活性的试剂在制备防治心肌梗死制剂中的应用。

优选的，采用反义寡核苷酸、antagomirs、mirna海绵、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-942-5p和/或mir-1262的转录和/或阻断mir-942-5p和/或mir-1262的活性。

本发明的目的在于提供检测mir-942-5p和/或mir-1262的靶基因制剂在制备诊断心肌梗死制剂中的应用。

所述靶基因为diana-microt、microrna.org、mirdb、rna22-has、targetminer、targetscan-vert数据库表明mir-942-5p和/或mir-1262的靶基因。

定义：

现阶段检测mirna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于pcr的mirna检测方法。基于探针杂交技术的mirna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增，包括northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)northern杂交

又称rna印迹技术为最经典的检测真核生物rna大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定mirna样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mirna序列互补的dna探针，然后与经过标记的样本mirna杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)mirna表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(rpa)

mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知mirna。

(4)rake法

rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞和肿瘤中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析，为从存档标本中分析mirna开启了希望之门。

(5)原位杂交(insituhybridization)

原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)

荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。由于mirna长度仅为22nt，传统的qrt-pcr不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于mirna的实时定量pcr方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的mirna检测qrt-pcr方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测mirna为模板逆转录合成cdna第一链，该cdna一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cdna的长度，随后以合成的cdna为模板设计引物进行实时定量pcr扩增。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的mirna都是通过cdna克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mirna的cdna文库，再进行pcr扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。takada开发了一种改进的扩增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cdna链的3’末端。当5’端接头与cdna链的poly(c)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cdna的pcr扩增。由于mrap高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中mirna的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(sage)技术的基础上发展了检测效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个mirna，明显提高了检测效率。

高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。

基于rna的microrna功能获得性技术即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性mirmimics技术该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。

mirna调控的主要方式有两种：一种是与靶基因mrna的3’utr不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调节基因表达；另一种是与sirna类似，当mirna与mrna完全互补配对时，ago2蛋白通过切割mrna直接导致其降解，实现基因沉默。总之，当前认为mirna以何种方式与目的基因作用和mirna与目的基因的配对程度有关。mirna与目的基因配对不完全时，mirna就以抑制目的基因的表达发挥作用；mirna与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。

附图说明

图1是mir-942-5p诊断心肌梗死的roc曲线图

图2是mir-1262诊断心肌梗死的roc曲线图

图3是mirna联合诊断心肌梗死的roc曲线图

图4是mir-942-5p和mir-1262相对表达量图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样品的收集及总rna提取

收集医院2015年3月到2016年9月心肌梗死患者外周血及健康对照外周血各6例。急性心肌梗死诊断标准：根据2012年第三次《心肌梗死全球统一定义》推荐的诊断标准制定。检测到心肌坏死标志物(主要是肌钙蛋白)水平上升和/或下降，至少有1次超过参考值上限的第99％百分位值，并至少伴有下列一项缺血的症状。

1)心肌缺血的症状；

2)新发生的缺血性ecg改变；

3)心电图出现病理性q波；

4)影像学证据显示有新的心肌活性丧失或新发的局部室壁运动异常；

5)冠状动脉造影或尸检发现冠状动脉内存在新鲜血栓。

血液rna提取标准：rna纯度：od260/280≧1.8，28s/18s≧1；rna完整性：rin值≧7.0。rna完整性检测方法：agilent2100(rna6000nanokit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5v/cm；时间：20min)。

实施例2测序、数据分析及电子验证

测序：运用lluminahiseq2500/miseq第二代高通量测序技术对mirna进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。通过转录组数据分析软件对mirna测序原始数据进行背景校正后进行t-test得到p值，然后利用fisher检验合并p值，筛选差异表达mirna。

最终从候选的差异表达mirna中挑选到mir-942-5p、mir-1262、mir-520c-3p，进行后期实验验证。

实施例3电子验证

电子验证：从geo(geneexpressionomnibus)数据库筛选得到3套mrna数据集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)和2套mirna数据集(gse61741、gse31568)，3套mrna数据集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)共有基因13680个，我们通过使用metama包采用合并p值法计算并合并效应值后得到612个(fdr<0.05)差异表达基因，其中上调352个，下调260个；2套数据集(gse24371,gse17498)共同mirna数目848个。使用r包metama对两套mirna数据集进行合并p值分析，找到15个差异表达mirna(fdr<0.001&&|combined.es|>1)。结果显示电子验证结果与测序结果表达趋势一致。

对于单个mirna分子或是诊断模型的效能评价的方法为建立受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线，通过计算曲线下面积(areaundercurve)来判断诊断的能力。roc曲线下的面积值在1.0和0.5之间，在auc>0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好，auc在0.5-0.7时有较低准确性，auc在0.7-0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时具有较高准确性。我们将利用gse31568数据集(包括70例对照组和20例病例组)，进而进行分析，结果显示，mir-942-5p诊断心肌梗死的auc为0.783(见图1)，mir-1262诊断心肌梗死的auc为0.748(见图2)，mir-520c-3p诊断心肌梗死的auc为0.729，显示其准确率较高，表明三者可以作为诊断心肌梗死的分子标志物，进一步联合诊断分析(见图3)，mir-520c-3p和mir-1262联合诊断心肌梗死的auc为0.776，mir-1262和mir-942-5p联合诊断心肌梗死的auc为0.805，mir-520c-3p、mir-1262和mir-942-5p联合诊断心肌梗死的auc为0.803。联合诊断的结果表明虽然三者auc值均比较高，但是不同mirna直接的联合有的效果更佳，如mir-1262和mir-942-5p，而有的反而更差，其中mir-1262和mir-942-5p的联合诊断效果接近0.805，显示出很高的准确率。

实施例4样品的采集及总rna的提取

1样品采集：

36例心肌梗死患者和22例健康对照人群外周血(采集时间2014年1月-2015年8月)。

2总rna提取：

相关实验物品的去rnase的处理：

①将所有玻璃器皿应用前均用depc冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。

②将塑料器皿(如：ep管/枪头)使用前需用0.1％depc水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。

白细胞分离

(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；

(2)加入等体积无菌pbs于外周血中充分混合，形成细胞悬液；

(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；

(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm20min；

(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷pbs洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入ep管中，离心去上清，用于提取rna。

rna提取

(1)从-80℃冰箱里取出样本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入trizol于ep管中，进行匀浆处理，室温静置5-l0min；

(2)每毫升trizol加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下12000转离心15min；

(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入等量异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

(4)4℃12000g离心10min，弃上清液，底部可见白色物质；

(5)加入1ml75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；

(6)4℃12000g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1depc水溶解rna。取3u1rna样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；1u1rna样品于紫外分光光度计检测浓度，以a260/280在1.8-2.0视为rna样本合格。

实施例5rt-pcr检测mir-942-5p和/或mir-1262的表达情况

1rt-pcr检测mir-942-5p和/或mir-1262的表达

逆转录

rt体系的配制：1μg总rna作为模板rna；5×miscripthispecbuffer4μl；10×nucleicsmix2μl；miscriptreversetranscriptasemix2μl；灭菌水补平至20μl。abi9700型pcr仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μlnuclease-freeh2o稀释至100μl储存在-20℃冰箱备用。

荧光定量pcr

mirna的rt-pcr体系的配制：

mir-942-5p的microrna-specificprimer引物为seqidno3，mir-1262的microrna-specificprimer引物为seqidno4。

反应体系：mirnas的表达检测每次设置3个平行管反应，以snrnau6作为内参。扩增程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。

3统计学分析

实时定量pcr样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；根据qrt-pcr的相对定量公式计算实验组与对照组目的基因表达的倍数关系，比较mir-942-5p和/或mir-1262在心肌梗死组和对照组中的表达水平。结果显示：mir-942-5p在患病组的表达量为对照组的约2.2倍，mir-1262在患病组的表达量为对照组的约2.1倍，以上结果验证了高通量测序数据分析的结果。58例样品中，mir-942-5p、mir-1262单独检测准确率为84.5％和82.8％，二者联合检测准确率为91.4％。显示mir-942-5p、mir-1262可单独或者合并用于心肌梗死疾病的检测。

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>mirna、组合物及其在诊断疾病中的应用

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