本发明属于生物医学领域，涉及用于诊断儿童i型糖尿病的分子标志物。
背景技术：
i型糖尿病(t1dm)为在遗传基础上由环境因素激发的、自身免疫介导的以胰腺β细胞受损为特征的自身免疫性疾病，是一种由于胰岛素缺乏或作用不足引起的能量代谢疾病。通常在儿童、少年、青年时期被诊断，发病风险最高的年龄段是10-14岁，青少年以后，发病率下降。儿童i型糖尿病以往多指小于15岁发生的糖尿病，由于who(世界卫生组织)已经儿童定义为0-18岁，因此儿童糖尿病应指小于18岁发生的糖尿病。儿童1型糖尿病的临床表现为多尿、多饮、多食及消瘦。儿童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病较急，不易早期发现，胰岛β细胞的功能可出现明显下降甚至发展为衰竭，早期并发症即可出现，如糖尿病酮症甚至酸中毒，如处理不及时或不当，可能危及生命。i型糖尿病确切发病机制尚未完全阐明，目前认为是遗传、免疫和环境因素共同作用所致。
高通量测序技术(high-throughputsequencing)是指能够一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性变革，随着2005年罗氏的454测序仪及2006年solexa测序仪出现后飞速发展，2009年左右高通量测序技术在国内兴起。高通量测序类型分为多种，基因芯片、基因深度测序(genomere-sequencing)、转录组深度测序(transcriptomere-sequencing又称rna-seq)等。
细胞的功能是从基因的表达开始的，转录组是指某一时间细胞内所有基因转录而来的rna总称。通过高通量测序技术可获得基因表达的rna水平有关信息，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。
高通量测序技术的快速发展和应用，为儿童i型糖尿病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也为儿童i型糖尿病的进一步治疗方案提供崭新思路。深入研究儿童i型糖尿病相关基因的调控机制，有助于了解儿童i型糖尿病的遗传分子机制，为寻找新的药物提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于诊断儿童i型糖尿病或者预测儿童i型糖尿病预后的基因标志物。本发明利用芯片和qpcr实验证明了cant1基因在儿童i型糖尿病患者的血液中的表达水平显著高于正常儿童，因此可将cant1基因作为诊断儿童i型糖尿病或者预测儿童i型糖尿病预后的基因标志物。
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测cant1基因表达的试剂在制备儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后产品中的应用。
进一步，所述试剂包括检测cant1基因mrna表达水平的试剂，和/或检测cant1蛋白表达水平的试剂。
检测cant1基因mrna表达水平的试剂是如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等定性地、定量地、或半定量地检测基因mrna表达水平的方法中使用的任何试剂。
进一步，所述检测cant1基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，和/或探针。
在本发明的具体实施方案中，所述检测cant1基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
上面所述的引物可以通过化学合成来制备，使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
前面所述的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
检测cant1蛋白表达水平的试剂是如elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等能够检测蛋白表达水平的方法中使用的任何试剂。
本发明可用于检测cant1蛋白表达水平的试剂包括针对cant1蛋白的抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
前面所述的本发明的所述产品检测的样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后的产品，所述产品包括前面所述的检测cant1基因表达的试剂。
进一步，本发明前面的所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断儿童i型糖尿病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知cant1基因的异常与儿童i型糖尿病相关也属于cant1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者含有cant1基因表达产物的样本；
(2)检测样本中cant1基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的cant1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来；
(4)与正常儿童相比，如果cant1基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为儿童i型糖尿病，或儿童i型糖尿病患者被确定为预后差。
在本发明的上下文中，“诊断儿童i型糖尿病”既包括判断受试者是否已经患有儿童i型糖尿病、也包括判断受试者是否存在患有儿童i型糖尿病的风险。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中cant1基因或cant1蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的人相比，更有可能观察到特定过程或结果。
如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(cdr)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即，通过双硫键相互连接的2个重(h)链以及2个轻(l)链)以及其多聚体(例如igm)。每个重链含有重链可变区以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域ch1、ch2和ch3。每个轻链含有轻链可变区以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(cl1)。vh与vl区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(cdr))，其中散布着较保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。
如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的dna的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的dna是已知的及/或很容易从例如市售来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该dna可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型fr3-cdr3-fr4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、cdr移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(smip)，以及鲨鱼可变ignar域。
“单克隆抗体”是由单克隆的b-淋巴细胞或由已经将编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染至其中的细胞或其后代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞来进行。这些融合细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。
“多特异性抗体”可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如tutt等,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等,2004,trendsbiotechnol.22:238-244。抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
具体的实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因
1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者10例，其中男5例，女5例，年龄5-16岁；正常对照组8例，其中男3例，女5例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。
2、样本采集与样本rna提取
儿童i型糖尿病和正常儿童在清晨空腹抽取静脉血。
血液中总rna的提取：
(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
(2)加入trizol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
(3)加入氯仿(氯仿：trizol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
(4)离心，12,000g15min，4℃。
(5)小心吸取上清液，转移到新ep管中,加入异丙醇(异丙醇：trizol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
(6)离心，12,000g10min，4℃。
(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：trizol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即rna略微出现透明时)，加入60μldepc水溶解沉淀。
3、rna样品的质量分析
利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化rna
illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cdna
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。
6、连接adaptor
双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。
7、ung酶消化cdna二链
在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。
8、illuminax-ten上机测序
illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；
(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；
(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因342个，其中表达上调的基因159个，表达下调的基因有183个。
实施例2实时荧光定量pcr实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因
1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者120例，其中男64例，女59例，年龄5-16岁(9.99士3.28)岁；正常对照组78例，其中男38例，女40例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16(10.51士3.25)岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。
2、血液总rna提取
儿童i型糖尿病和正常儿童在清晨空腹抽取静脉血。
血液中总rna的提取：
(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
(2)加入trizol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
(3)加入氯仿(氯仿：trizol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
(4)离心，12,000g15min，4℃。
(5)小心吸取上清液，转移到新ep管中,加入异丙醇(异丙醇：trizol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
(6)离心，12,000g10min，4℃。
(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：trizol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即rna略微出现透明时)，加入60μldepc水溶解沉淀。
3、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
4、实时荧光定量pcr
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。
引物序列如下：
扩增cant1基因的正向引物序列为5’-gccaactggtacaatgac-3’(seqidno.1)，反向引物序列为5’-tctgcgataactgcgatt-3’(seqidno.2)；
扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。
扩增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*40个循环。以sybr
green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。
5、结果
结果显示，以正常儿童组的mrna相对表达水平为1，儿童i型糖尿病组cant1基因mrna水平为15.24±4.15，显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例3免疫印迹实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达基因的表达产物
1、临床对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
儿童i型糖尿病患者和正常儿童取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚红1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的hbss洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用hbss溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、westernblot检测
细胞总蛋白用brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80v恒压，看见marker后增加至120v；将电泳后的胶取出，使用bio.rad半干转印系统于100v转移50min；转膜完毕后，用1xpbs洗一次，浸入封闭液，40c过夜；倒掉封闭液，加入western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ecl试剂显影、定影检测蛋白表达。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用imagej软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果显示，以正常儿童组的蛋白相对表达水平为1，儿童i型糖尿病组cant1蛋白水平为5.12±1.03，显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
sequencelisting
<110>北京泱深生物信息技术有限公司
<120>儿童i型糖尿病的基因标志物
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