本发明属于微生物技术领域，具体而言，本发明涉及新的分离自海水的嗜气芽孢杆菌，其经过发酵后具有防治根结线虫的作用。
背景技术：
嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）多数是从海洋中分离得到的，不同的菌株具有不同的性质，例如，中国专利申请201410168127公开一种嗜气芽孢杆菌，其保藏号为cgmccno.8840，用于降解石油烃，提高治理海洋石油污染的效率；又如，中国专利申请201510314671公开一种嗜气芽孢杆菌fe2，其保藏号为cgmccno.10662，其发酵上清液可完全抑制黄曲霉素的产生，用于饲料、粮食、大田作物等的黄曲霉素污染的有效防控。
植物病原线虫对农作物的危害大，常造成严重的经济损失。目前根结线虫的防治方法包括轮作防病、抗线虫品种培育、化学防治和生物防治等。其中，轮作防病被广泛使用，但对一些特殊经济作物或特定地区无法达到合理轮作的要求，具有较大的局限性。常规抗病育种因研究进展缓慢而不被大家重视。由于化学杀线虫药剂的使用可以起到立竿见影的预期效果而被大家广泛使用，但化学药剂的长期使用带来了一系列的副作用，如药剂残留造成环境污染、次要病害猖獗发生、抗性丧失等，正逐步被限制使用。
目前还没有发现嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）能用于防治根结线虫对农作物的为害。本发明人凭借长期研究积累的经验，幸运地分离到了一株新的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus），发现其经过发酵后具有防治根结线虫的作用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种新的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）。另外，本发明还提供了该菌株的16srrna基因片段、发酵液、发酵方法以及防治根结线虫的应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，其保藏号为cgmccno.14104。该菌株分离自海水，已于2017年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其菌体为杆状，大小为（0.2~0.3）µm×（1.0~1.7）µm，能运动，产芽孢，革兰氏染色呈阳性。在lb培养基上25℃培养48h，菌落呈乳白色，凸起，边缘规则，不透明，菌落直径大小为1~1.5mm。本发明人发现了该菌株，尤其是其发酵液，具有防治线虫的作用。
在第二方面，本发明提供了嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的16srrna基因片段，其核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明人发现了新的菌株（即，本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01），从来源、镜检和培养等角度来看，其为嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus），通过对16srrna基因测序也从分子生物学角度鉴定了该菌株。
在第三方面，本发明提供了嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的发酵培养基，其配方为玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性淀粉5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1000ml，ph为7.2-7.4。本发明第三方面的发酵培养基中的成分可以等比例地放大或缩小，例如其配方为玉米粉1g，豆粕粉1g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠0.5g，蒸馏水定容至100ml，ph为7.2-7.4，这些也都在本发明的保护范围内。
本发明人发现了使用本发明第三方面的发酵培养基可以培养本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，而且培养获得的发酵液具有防治根结线虫的作用。因此，在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的发酵培养基在培养本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的应用。
相应地，在第五方面，本发明提供了嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的发酵液，其通过将本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接种于本发明第三方面的发酵培养基培养而得。
另外，在第六方面，本发明提供了嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的发酵液的制备方法，其是将本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接种于本发明第三方面的发酵培养基培养。
优选在本发明第五或第六方面中，所述培养的条件是28-30℃（如，30℃）下振荡培养3-5天。振荡的条件是100-300rpm，优选是150-250rpm，如200rpm。
也优选在本发明第五或第六方面中，本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01是经过活化和/或种子培养的，优选先活化然后种子培养以扩大菌量。优选其中，用2216e培养基或lb培养基进行活化和/或种子培养的。通常活化是在固体培养基上进行的，其中培养基每1000ml另加琼脂15-20g，种子培养和发酵培养是在液体培养基中进行，其中无需加琼脂。
在第七方面，本发明提供了本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01或本发明第五方面的发酵液在防治农作物根结线虫中的应用。
相应地，在第八方面，本发明提供了防治农作物根结线虫的方法，向农作物或种植其的土壤施用本发明第五方面的发酵液。
优选在本发明第七或第八方面中，农作物是番茄。
在第九方面，本发明提供了本发明第二方面的16srrna基因片段在鉴定本发明第一方面的嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的应用。通过测定待测菌株的16srrna基因的序列，将测序结果与本发明第二方面的16srrna基因片段相比较，由此可以进行鉴定。
本发明的有益效果在于，发现了具有防治根结线虫作用的嗜气芽孢杆菌zdxc-01或其发酵液，该菌株生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物根部能够快速大量定殖，其防治线虫的活性可以有效替代现有的化学农药，具有良好的应用前景。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步示例性地说明本发明。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所知晓的，包括可以商业化委托鉴定，所用的器械和试剂也均可通过商业渠道购买。
实施例1嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的发现及鉴定
本发明人从海水中用稀释涂布法分离单克隆菌株，具体分离方法为：称取1ml海水样品溶于99ml无菌水中，振荡使其充分混合，即获得10-2海水稀释液。取1ml上述海水稀释液至9ml无菌水中，摇匀即获得10-3海水稀释液。相同的方法配置10-4、10-5、10-6的海水稀释液。取10-4、10-5、10-6的海水稀释液100μl于加琼脂的2216e培养基平板中，用涂布器将稀释液均匀涂布，平板置于28-30℃的恒温箱中培养24h，将培养基上的不同形态的菌落在空白2216e培养基平板中进行划线，纯化获得的菌株，并分别编号保存。其中，一菌株镜检特性为，菌体杆状，大小为（0.2~0.3）µm×（1.0~1.7）µm，能运动，产芽孢，革兰氏染色呈阳性；该菌株在lb培养基上25℃培养48h，菌落呈乳白色，凸起，边缘规则，不透明，菌落直径大小为1~1.5mm；对该菌株的16srrna基因测序，显示其16srrna基因片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。综合鉴定结果，该菌株是现有技术未被公开的菌株，被命名为嗜气芽孢杆菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，于2017年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为cgmccno.14104。
实施例2抗根结线虫发酵液的制备
大量制备嗜气芽孢杆菌zdxc-01的发酵过程如下：
（1）将保存在试管斜面中的嗜气芽孢杆菌zdxc-01划线于加琼脂的2216e培养基或lb培养基进行活化，置于28-30℃恒温培养箱培养3天；
（2）将步骤（1）的嗜气芽孢杆菌zdxc-01的孢子移植到2216e（酵母提取物1g，蛋白胨5g，过滤后的海水1000ml，ph7.2-7.4）或lb液体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.2-7.4）中，28-30℃摇床振荡培养3天，得到种子液；
（3）按10%比例（体积比）将种子液接种到发酵培养基（玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性淀粉5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4）中，28-30℃下振荡培养3-5天，得到嗜气芽孢杆菌zdxc-01的抗根结线虫发酵液。
实施例3抗番茄根结线虫的室内离体试验
1.1供试药剂的准备
按照实施例2新鲜制备的嗜气芽孢杆菌zdxc-01的抗根结线虫发酵液。
1.2供试线虫的准备
供试线虫由番茄保护地的番茄病根上获取。取番茄病根，用蒸馏水清洗表面土壤后，用解剖针挑取根结内部卵块，放入装有无菌水的培养皿中，28℃静置孵化24h；收集孵化的根结线虫二龄幼虫，于三角瓶中轻轻混匀，获得线虫悬液（约100条/ml），4℃保存备用。
1.3试验设计
以采集的番茄根结线虫为供试线虫，采用24孔板液体浸渍法进行抗根结线虫活性室内测定。在24孔板中分别加入100μl线虫悬液、100μl抗根结线虫发酵液和300μl无菌水，用移液器轻轻吹打均匀，试验设置三个重复，以空白发酵培养基代替发酵液作对照。于28℃放置24h后在倒置显微镜下观察，虫体僵直或卷曲的即视为击倒，计算线虫校正击倒率。向24孔板中加入600μl无菌水，观察恢复情况，不能恢复活性的记为死亡，计算校正死亡率。
1.4计算方法
校正击倒率(%)=100%×(处理击倒率-对照击倒率)/(1-对照击倒率)
校正死亡率(%)=（1-恢复率）×校正击倒率
1.5试验结果
试验结果表明，嗜气芽孢杆菌zdxc-01发酵液对根结线虫的校正死亡率平均为78.3%。
实施例4测定番茄根结线虫防效的盆栽试验
1.1供试药剂
按照实施例2新鲜制备的嗜气芽孢杆菌zdxc-01的抗根结线虫发酵液；市售的1.8%阿维菌素乳油（作为阳性对照）。
1.2供试作物与防治对象：
供试作物：番茄，品种为“大明星”
防治对象：番茄根结线虫
1.3供试土壤
供试沙壤土经100℃高温灭菌30min，经检查无线虫存活后，向其中加入线虫悬液，使土壤中根结线虫浓度为5条/10g。加入线虫悬液后的土壤称为带线土，每个花盆装带线土2kg。
1.4试验设计及安排
将番茄种子用1%次氯酸钠表面消毒10min后，用无菌水冲洗3遍，于培养皿中催芽后播种。待番茄幼苗达到5叶龄时，将长势一致的苗子移栽到装有带线土的花盆中，每盆3株。试验共有4处理，①加入50ml抗根结线虫发酵液；②加入100ml抗根结线虫发酵液；③加入50ml稀释2000倍的1.8%阿维菌素乳油；④对照（加入100ml发酵培养基）。每个处理3盆番茄幼苗，试验重复3次。
1.5试验调查及计算方法
试验30天及45天后检查试验结果。检查时将番茄苗与土全部取出，用流水缓缓冲洗根部，直至将泥土全部冲掉，每株番茄幼苗根部分东、西、南、北、中五个方位随机采样，每个方位选取2个完整根，共计10个。统计番茄根部根瘤发生的严重程度，进行病情分级，计算防治效果。
番茄根结线虫病情分级标准：
0级：无可见根瘤或卵块；
1级：根瘤长度占总根长度的1-10%；
3级：根瘤长度占总根长度的11-30%；
5级：根瘤长度占总根长度的31-50%；
7级：根瘤长度占总根长度的51-70%；
9级：根瘤长度占总根长度的71%以上；
按下列公式计算病情指数和防治效果：
病情指数=100×(∑(各病级植株数×病级数值))/(调查总数值×9)
防治效果(%)=100%×(空白对照区病指-处理区病指)/空白对照区病指
2.结果
供试药剂对番茄根结线虫的防治效果如表1所示。
表1嗜气芽孢杆菌zdxc-01抗根结线虫发酵液对番茄根结线虫的盆栽试验
试验结果表明，嗜气芽孢杆菌zdxc-01抗根结线虫发酵液对番茄根结线虫有可持续的较好防治效果，可以代替阿维菌素使用。番茄幼苗移栽30天后，嗜气芽孢杆菌zdxc-01抗根结线虫发酵液对番茄根结线虫的防效为65.24-69.52%，嗜气芽孢杆菌zdxc-01发酵液50ml与阿维菌素乳油的处理在防效上已经无显著性差异。番茄幼苗移栽45天后，嗜气芽孢杆菌zdxc-01抗根结线虫发酵液100ml的防效为74.12%，嗜气芽孢杆菌zdxc-01抗根结线虫发酵液50ml与阿维菌素乳油的处理仍然无显著性差异。
序列表
<110>青岛中达农业科技有限公司
<120>嗜气芽孢杆菌及其杀根结线虫应用
<130>cn
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1509
<212>dna
<213>bacillusaerophilus
<400>1
ctcaggacgaacgctggcggcgtggctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagct60
tgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagact120
gggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaag180
gatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggt240
gaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacac300
tgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatg360
gacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctc420
tgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccag480
aaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtcc540
ggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccg600
gctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaa660
ttccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgact720
ctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacc780
ctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtg840
ctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaa900
ggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaa960
gaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcgggg1020
acagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1080
cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg1140
actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200
cctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttag1260
ccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagct1320
ggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1380
caccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatgg1440
agccagccgccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatc1500
ggaaggtgc1509
序列表
<110>青岛中达农业科技有限公司
<120>嗜气芽孢杆菌及其杀根结线虫应用
<130>cn
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1509
<212>dna
<213>bacillusaerophilus
<400>1
ctcaggacgaacgctggcggcgtggctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagct60
tgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagact120
gggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaag180
gatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggt240
gaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacac300
tgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatg360
gacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctc420
tgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccag480
aaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtcc540
ggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccg600
gctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaa660
ttccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgact720
ctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacc780
ctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtg840
ctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaa900
ggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaa960
gaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcgggg1020
acagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1080
cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg1140
actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200
cctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttag1260
ccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagct1320
ggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1380
caccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatgg1440
agccagccgccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatc1500
ggaaggtgc1509