利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法与流程

文档序号:11212304阅读:1185来源:国知局

本发明属于发酵技术领域,特别是涉及一种利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法。



背景技术:

利福霉素是由地中海拟无枝酸菌产生的一类安莎大环内酯类抗生素。这类抗生素的毒性低、疗效高且抗菌谱较广,广泛应用于治疗g+(革兰氏阳性菌)、结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝杆菌感染。

从20世纪50年代末期发现利福霉素之后,对其结构性质及其发酵工艺进行了大量的研究,发酵单位有了很大的提高,但近年来我国利福霉素的工业化水平提高缓慢,存在的问题主要是:

1国内利福霉素发酵生产单位较低,60m3发酵罐发酵单位不超过22000u/ml,同国际生产技术水平存在一定的差距。

2利福霉素生产周期一般在200-220h,发酵周期较长,能耗较高。

基于以上原因,导致利福霉素生产成本较高,国际市场竞争力较弱。



技术实现要素:

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种可有效提高利福霉素发酵单位,缩短发酵周期,降低生产成本,同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响,且原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现利福霉素稳定、高效生产的培养基。

本发明的另一目的是提供一种利用上述培养基生产利福霉素的培养方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为:

一种利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其中

所述一级种子培养基组成为:转化糖蜜13~17g/l、蝇蛆干粉12~16g/l、菌体蛋白9~13g/l、酵母自溶粉fm9018~12g/l、轻质碳酸钙1~5g/l、硫酸铵0.5~0.9g/l;

所述二级种子培养基组成为:转化糖蜜16~20g/l、蝇蛆干粉14~18g/l、菌体蛋白11~15g/l、酵母自溶粉fm9015~9g/l、微生物复合氮素ft1008~12g/l、轻质碳酸钙1~5g/l、硫酸铵0.5~0.9g/l;

所述发酵培养基组成为:甘油13~17ml/l、转化糖蜜22~26g/l、蝇蛆干粉17~21g/l、菌体蛋白13~17g/l、酵母自溶粉fm9017~11g/l、微生物复合氮素ft10011~15g/l、轻质碳酸钙1~5g/l、硫酸铵0.5~0.9g/l、氧化铝0.03~0.07g/l、磷酸镁0.01~0.05g/l、氯化钴0.004~0.008g/l、磷酸二氢钾0.02~0.06g/l、硫酸锰0.002~0.006g/l。

一种利用上述培养基发酵生产利福霉素的培养方法,其特征在于工艺步骤为:

1)一级种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液接入一级种子培养基中进行一级种子培养,至菌体浓度40~45%、培养时间65~70h移种;

2)二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养液移入二级种子培养基中进行二级种子培养,至菌体浓度35~39%、培养时间40~45h时移种;

3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,至菌体浓度34~38%、发酵周期不超过190h,化学效价>30000u/ml时终止发酵。

所述培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液质量要求为菌体浓度20~30%;镜检无杂菌,移种量为0.5-0.6l/m3

所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:40~60m3/h;搅拌转速50~60r/min;

所述二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:120~150m3/h;搅拌转速70~80r/min。

所述发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.6~7.0;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在90~100r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

所述发酵培养过程中采用流加法进行补料,包括补糖和补氮,其中

所述补糖是指补入转化糖蜜,当发酵液中溶氧超过60%,匀速补入转化糖蜜,补入速率为12-13l/(m3·h),当溶氧达到25%后停止补料;

所述补氮是指补入质量浓度为50~60%的微生物复合氮素ft100,当发酵液ph超过6.8,匀速补入微生物复合氮素ft100,补入速率为8-9l/(m3·h),当ph为6.2时,停止补料。

本发明的技术优势体现在:

1本发明确认了地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。

2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述,确认了利福霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产利福霉素,其128m3发酵罐生产发酵单位达到27000u/ml以上,与国外生产技术水平几乎持平。

3利福霉素发酵周期控制在190-200h,同国内比较,发酵周期缩短了10h,降低了发酵能耗。

3本发明适用于工业化规模化发酵生产利福霉素。

具体实施方法

下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例的菌种选用:生产使用的菌种来源是地中海拟无枝酸菌发酵液。母瓶发酵液质量要求为:菌体浓度20~30%;镜检无杂菌。

培养基中使用的酵母自溶粉fm901和微生物复合氮素ft100由安琪酵母股份有限公司提供。

实施例1

一级种子培养:种子培养基体积1m3

转化糖蜜13kg、蝇蛆干粉12kg、菌体蛋白9kg、酵母自溶粉fm9018kg、轻质碳酸钙1kg、硫酸铵0.5kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至20℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液500ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:40m3/h;搅拌转速50r/min。

至菌体浓度40%、培养时间65h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

转化糖蜜160kg、蝇蛆干粉140kg、菌体蛋白110kg、酵母自溶粉fm90150kg、微生物复合氮素ft10080kg、轻质碳酸钙10kg、硫酸铵5kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:120m3/h;搅拌转速70r/min。

至菌体浓度35%、培养时间40h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

甘油1300l、转化糖蜜2200kg、蝇蛆干粉1700kg、菌体蛋白1300kg、酵母自溶粉fm901700kg、微生物复合氮素ft1001100kg、轻质碳酸钙100kg、硫酸铵50kg、氧化铝3kg、磷酸镁1kg、氯化钴0.4kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸锰0.2kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至20℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.6;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在90r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度34%、发酵周期190h,化学效价28273u/ml时终止发酵。

实施例2

一级种子培养:种子培养基体积1m3

转化糖蜜14kg、蝇蛆干粉13kg、菌体蛋白10kg、酵母自溶粉fm9019kg、轻质碳酸钙2kg、硫酸铵0.6kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至22℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液520ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:45m3/h;搅拌转速53r/min。

至菌体浓度41%、培养时间66h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

转化糖蜜170kg、蝇蛆干粉150kg、菌体蛋白120kg、酵母自溶粉fm90160kg、微生物复合氮素ft10090kg、轻质碳酸钙11kg、硫酸铵6kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至22℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:125m3/h;搅拌转速73r/min。

至菌体浓度36%、培养时间41h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

甘油1400l、转化糖蜜2300kg、蝇蛆干粉1800kg、菌体蛋白1400kg、酵母自溶粉fm901800kg、微生物复合氮素ft1001200kg、轻质碳酸钙110kg、硫酸铵60kg、氧化铝4kg、磷酸镁2kg、氯化钴0.5kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸锰0.3kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至22℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.7;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在93r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度35%、发酵周期192h,化学效价28364u/ml时终止发酵。

实施例3

一级种子培养:种子培养基体积1m3

转化糖蜜15kg、蝇蛆干粉14kg、菌体蛋白11kg、酵母自溶粉fm90110kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵0.7kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至23℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液550ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速55r/min。

至菌体浓度42%、培养时间67h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

转化糖蜜180kg、蝇蛆干粉160kg、菌体蛋白130kg、酵母自溶粉fm90170kg、微生物复合氮素ft100100kg、轻质碳酸钙12kg、硫酸铵7kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至23℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:130m3/h;搅拌转速75r/min。

至菌体浓度37%、培养时间42h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

甘油1500l、转化糖蜜2400kg、蝇蛆干粉1900kg、菌体蛋白1500kg、酵母自溶粉fm901900kg、微生物复合氮素ft1001300kg、轻质碳酸钙120kg、硫酸铵70kg、氧化铝5kg、磷酸镁3kg、氯化钴0.6kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸锰0.4kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至23℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.8;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在95r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度36%、发酵周期195h,化学效价28527u/ml时终止发酵。

实施例4

一级种子培养:种子培养基体积1m3

转化糖蜜16kg、蝇蛆干粉15kg、菌体蛋白12kg、酵母自溶粉fm90111kg、轻质碳酸钙4kg、硫酸铵0.8kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至24℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液570ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:55m3/h;搅拌转速57r/min。

至菌体浓度44%、培养时间69h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

转化糖蜜190kg、蝇蛆干粉170kg、菌体蛋白140kg、酵母自溶粉fm90180kg、微生物复合氮素ft100110kg、轻质碳酸钙13kg、硫酸铵8kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至24℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:135m3/h;搅拌转速78r/min。

至菌体浓度38%、培养时间44h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

甘油1600l、转化糖蜜2500kg、蝇蛆干粉2000kg、菌体蛋白1600kg、酵母自溶粉fm9011000kg、微生物复合氮素ft1001200kg、轻质碳酸钙130kg、硫酸铵80kg、氧化铝6kg、磷酸镁4kg、氯化钴0.7kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸锰0.5kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至24℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.9;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在97r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度37%、发酵周期198h,化学效价28405u/ml时终止发酵。

实施例5

一级种子培养:种子培养基体积1m3

转化糖蜜17kg、蝇蛆干粉16kg、菌体蛋白13kg、酵母自溶粉fm90112kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵0.9kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至25℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液600ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:60m3/h;搅拌转速60r/min。

至菌体浓度45%、培养时间70h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

转化糖蜜200kg、蝇蛆干粉180kg、菌体蛋白150kg、酵母自溶粉fm90190kg、微生物复合氮素ft100120kg、轻质碳酸钙14kg、硫酸铵9kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至25℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:140m3/h;搅拌转速80r/min。

至菌体浓度39%、培养时间45h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

甘油1700l、转化糖蜜2600kg、蝇蛆干粉2100kg、菌体蛋白1700kg、酵母自溶粉fm9011100kg、微生物复合氮素ft1001300kg、轻质碳酸钙140kg、硫酸铵90kg、氧化铝7kg、磷酸镁5kg、氯化钴0.8kg、磷酸二氢钾6kg、硫酸锰0.6kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至24℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在7.0;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在100r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度38%、发酵周期200h,化学效价28217u/ml时终止发酵。

上述实施例1-5中,发酵过程中采用流加法进行补料:

转化糖蜜补料工艺:当溶氧超过60%,匀速补入转化糖蜜,补入速率为12-13l/(m3·h)。当溶氧达到25%后停止补料。

微生物复合氮素ft100:配置微生物符合氮素ft100溶液,浓度控制在50-60%。当ph超过6.8,匀速补入微生物复合氮素ft100,补入速率为8-9l/(m3·h)。当ph为6.2时,停止补料。

对比实施例

一级种子培养:种子培养基体积1m3

淀粉15kg、葡萄糖9kg、黄豆饼粉12kg、鱼粉8kg、蛋白胨6kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵0.7kg。

首先将种子培养基灭菌并冷却至23℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的地中海拟无枝酸菌母瓶发酵液550ml接入一级种子培养基中进行种子培养。

培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~39℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速55r/min。

至菌体浓度35%、培养时间70h移种。

二级种子培养:种子培养基体积10m3

淀粉180kg、葡萄糖100kg、黄豆饼粉160kg、鱼粉85kg、蛋白胨60kg、酵母粉70kg、轻质碳酸钙12kg、硫酸铵8kg。

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至23℃,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养。

二级级种子培养条件为:罐压0.03~0.06mpa;罐温28~29℃;空气流量:130m3/h;搅拌转速75r/min。

至菌体浓度36%、培养时间46h时移入发酵培养基。

发酵培养:发酵培养基体积100m3

淀粉1500l、葡萄糖1200kg、黄豆饼粉1900kg、鱼粉950kg、酵母粉900kg、蛋白胨800kg、轻质碳酸钙120kg、硫酸铵70kg、氯化钴0.6kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸锰0.4kg。

先将发酵培养基灭菌,冷却至23℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:

a培养基初始ph:发酵培养基灭菌后ph控制在6.8;

b温度:培养温度28~29℃,

c搅拌转速:转速控制在95r/min,

d压力控制:罐压0.05~0.06mpa,

eph控制:发酵过程中ph控制在6~7,

f溶氧控制:发酵过程中,溶氧含量控制在25%以上。

至菌体浓度35%、发酵周期210h,化学效价20482u/ml时终止发酵。

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