线粒体MT-CO1在筛查脓毒症中的用途的制作方法

文档序号:15937109发布日期:2018-11-14 02:34阅读:529来源:国知局
本发明涉及疾病诊断或筛查领域,具体涉及线粒体mt-co1在筛查脓毒症中的用途。
背景技术
脓毒症(sepsis)是一种由感染因素诱发过度的、失控的全身性炎症进而导致多器官功能障碍甚至衰竭的临床症候群。随着现代医学的发展,特别是微生物学和免疫学的进步,对于脓毒症的发病机制研究不断深入。抗生素和器官支持技术的出现,对于脓毒症的治疗起到了重要的促进作用。尽管如此,脓毒症的发病率和病死率仍然居高不下。据估计全世界每年可有多达1900万人罹患,而病死率仍然高达20-30%。脓毒症患者的临床表现十分多样,即使相同的感染,不同患者之间疾病发生、发展和预后不同,越来越多的学者开始意识到,脓毒症的病理改变具有明显的个体差异,而不同的遗传背景是导致患者间个体差异最主要的因素之一,因此,对于脓毒症的遗传学研究成为目前的研究热点之一。但以往的研究多集中在核基因与脓毒症的方面。线粒体作为细胞内负责氧代谢及能量代谢的细胞器,是绝大多数细胞进行电子转移和呼吸运动的场所,同时也具有维持钙平衡、细胞信号通路、调节转录等功能。此外,线粒体也具有调节细胞生长和细胞周期的作用,并参与细胞凋亡的信号通路。早在1962年,线粒体与人类疾病的关系就得到了关注和研究,非甲状腺性严重代谢亢进的病例就与线粒体功能缺陷之间的关联被报道(luftr,ikkosd,palmierig,etal.acaseofseverehypermetabolismofnonthyroidoriginwithadefectinthemaintenanceofmitochondrialrespiratorycontrol:acorrelatedclinical,biochemical,andmorphologicalstudy.jclininvest1962;41:1776-1804)。随着对于基因和细胞生物学研究的不断深入,研究手段的不断丰富,对于线粒体在人类疾病的关系得到不断的明确,有近600多种发生在线粒体上的基因突变被发现,其中与心血管疾病、耳聋、线粒体肌病等疾病的联系已经得到了确认(schapiraah.mitochondrialdiseases.lancet2012;379(9828):1825-1834)。然而,线粒体与脓毒症之间的关联性有待进一步明确。技术实现要素:本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供基于线粒体基因或多肽链的诊断和筛查脓毒症的方法。关于线粒体基因在脓毒症的发生发展中所起的作用,相关研究甚少,而本发明的发明人分析了1个三代7人的中国汉族家系,以探寻线粒体基因突变在脓毒症的发生发展中的作用。结果发现,mt-co1基因第6459位碱基发生突变的个体中脓毒症的遗传易感性增加。因此,本发明第一方面提供了一种非诊断目的地筛查脓毒症易感个体的方法,该方法包括:分析个体的线粒体mt-co1基因第6459位碱基和/或线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸是否存在突变。本发明第二方面提供了用于分析线粒体mt-co1基因第6459位碱基是否突变和/或线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸是否突变的试剂在制备用于诊断或筛查脓毒症的医疗器具中的用途。通过上述技术方案,本发明基于线粒体mt-co1基因或多肽链能够实现脓毒症的早期诊断或筛查,有利于易感个体的感染预防。另外,在确诊时辅以本发明的方法有利于早期确诊,从而便于对患者及时有效的进行治疗。附图说明图1是携带mtdnat6459c突变脓毒症3代家系图;图2是家系成员线粒体基因6459位点测序结果示意图;图3是突变组与非突变组细胞活性氧水平结果图;图4是突变组与非突变组流式细胞仪测定线粒体膜电位结果图;图5是突变组与非突变组线粒体膜电位比较图;图6是突变组与非突变组流式细胞仪测定细胞凋亡结果图;图7是突变组与非突变组细胞凋亡比较图;图8是突变组与非突变组细胞的atp含量比较图。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本发明中,在未作相反说明的情况下,使用的术语“线粒体mt-co1基因”是指线粒体dna(ncbireferencesequence:nc_012920.1)中编码co1(mitochondriallyencodedcytochromecoxidasei)多肽链的基因(5904-7445),该基因的碱基序列中某碱基的位置编号以其在完整线粒体基因中的位置编号为准,而“线粒体mt-co1多肽链”为相应的多肽链;“筛查”是指对未出现临床症状(或通过其它诊断方法确认未得脓毒症)的个体进行排查,以确认其是否具有脓毒症易感性,因此筛查属于非诊断目的的方法。本发明提供的(非诊断目的地)筛查脓毒症易感个体的方法包括:分析个体的线粒体mt-co1基因第6459位碱基和/或线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸是否存在突变。本发明的发明人发现,存在上述突变的个体具有脓毒症易感性。其中,所述突变优选为碱基置换突变。只要分析线粒体mt-co1基因或线粒体mt-co1多肽链是否存在上述突变即可实现本发明的目的,本领域技术人员公知的是,通常线粒体mt-co1基因第6459位碱基为t,线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸残基为色氨酸(w)。线粒体mt-co1基因第6459位碱基的突变可以指任意碱基置换突变,如,t突变为c或g。相应地,突变后,线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸残基由w突变为精氨酸(r)或甘氨酸(g)。根据本发明最优选的实施方式,基因突变的方式为t6459c,多肽链突变的方式为w186r。其中,“t6459c”或“t6459c突变(或mtdnat6459c突变)”是指线粒体dna的第6459位碱基t突变为碱基c的碱基置换突变;类似地,“w186r”指多肽链的第186位氨基酸w突变为氨基酸r,下同。根据本发明,分析是否存在上述突变的方法可以为本领域常用的分析方法,例如,分析是否突变的方式为测序。测序的方法为本领域技术人员所熟知,且可以委托测序公司完成。测序后只要与ncbi中的参比序列进行比较即可得知是否存在突变。根据本发明,所述个体可以为各种待筛查的个体,可以为能够感染脓毒症的哺乳动物,特别是灵长类动物,优选为人,更优选为中国汉族人。此外,本发明提供了用于分析线粒体mt-co1基因第6459位碱基是否突变和/或线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸是否突变的试剂在制备用于诊断或筛查脓毒症的医疗器具中的用途。突变的方式(或类型)以及分析是否突变的方法如前所述,在此不再赘述。本发明中,所述医疗器具可以为各种含上述试剂的器具(诊断器具或筛查器具),例如,所述医疗器具可以为试剂盒。所述试剂是常规的能够分析是否突变的试剂,如线粒体dna提取试剂、缓冲液等。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例11材料和方法1.1研究对象根据前期病例组100例脓毒症患者的线粒体dna全序列分析结果,以携带mtdnat6459c突变的1名脓毒症患者为先证者(proband),先证者为河北省保定籍,男性,49岁,初以口腔颌面部感染起病,继发肺炎、纵膈感染,出现肝功能衰竭、凝血功能障碍等表现,根据sepsis-3诊断标准(marshalljc.sepsis-3:whatisthemeaningofadefinition?critcaremed2016;44(8):1459-1460),脓毒症的诊断明确。家系中先证者所处母系遗传成员为ⅰ-1、ⅱ-1、ⅱ-2、ⅱ-4,非该母系遗传成员为ⅱ-3、ⅲ-1、ⅲ-2。病例组脓毒症患者纳入标准:本实验通过中国人民解放军总医院伦理委员会审查批准,所有受试者均签署知情同意书。1.2研究方法1.2.1记录受试者一般资料记录该家系全部7名受试者年龄、性别、身高、体重、bmi指数、既往病史,并抽取静脉血进行血常规、血生化、凝血功能检测。1.2.2采集受试者静脉血标本家系内7名受试者通过肘正中静脉取血法抽取静脉血标本,提取线粒体dna进行测序,如图1-2,并留取5ml静脉血标本用以建立细胞系。所有静脉血标本均通过epta抗凝后常温保存。1.2.3线粒体基因的分析用试剂盒(promegawizard,a1120,usa)提取全血中的线粒体dna。设计引物扩增线粒体中的24个dna片段,引物的设计原则遵循:①引物长度不应超过19-29bp;②引物序列在模板内不能有相似度较高的序列,特别是是3’端相似性较高的序列,尽量不能出现连续3个碱基相同的序列;③引物序列的gc含量一般为50%;④引物所对应模板位置序列的tm值在71℃左右,以使复性条件最好;⑤pcr产物长度不超过900bp,并且足够覆盖线粒体全基因组。最终得到的引物的序列如下表1-1所示:表1-1使用qiaexii纯化试剂盒(qiagen)提纯pcr产物,再用abi3700dna自动测序仪直接进行测序和分析。线粒体dna测序结果以及相应蛋白序列的比较和分析采用seqwebprogramgap(gcg)。所有测序结果均与cambridgereferencesequence进行比较(比较源:mitomap(http://www.mitomap.org))。1.2.4建立受试者淋巴细胞系采用eb病毒转染外周静脉血标本中的单个核细胞,通过cpgdna序列诱导b淋巴细胞增殖和环孢素a抑制t淋巴细胞增殖,最终建立相应受试者的永生化b淋巴细胞细胞系。1.2.5细胞活性氧(ros)水平测定所用试剂:碧云天活性氧检测试剂盒,仪器:bdfacsverse流式细胞检测仪、stratos台式高速冷冻离心机。使用不含血清的1640培养液稀释dcfh-da;选取处于对数生长期的所有受试者细胞系,在选定浓度脂多糖(lps,购自美国sigma公司)刺激后,在无刺激条件和刺激6小时后混匀细胞悬液并离心重悬孵育;每隔3-5min颠倒混匀以使细胞与探针充分接触,洗涤去除dcfh-da;重悬后置入流式细胞检测仪进行监测并记录;重复试验3次。1.2.6线粒体膜电位测定所需试剂及仪器:碧云天线粒体膜电位检测试剂盒,bdfacsverse流式细胞检测仪、vortex-5型涡旋振荡器、stratos台式高速冷冻离心机。选取处于对数生长期的所有受试者细胞系,在选定浓度lps刺激后,在刺激后0小时和选定时间点混匀细胞悬液;收集细胞重悬,加入jc-1工作液混匀后孵育离心,加入jc-1缓冲液洗涤后重悬;样品置入流式细胞检测仪进行监测并记录;重复试验3次。1.2.7细胞凋亡状态测定所需试剂及仪器:bdannexinv-fitc/pi细胞凋亡双染试剂盒,bdfacsverse流式细胞检测仪、stratos台式高速冷冻离心机。选取处于对数生长期的所有受试者细胞系,在无刺激条件,和选定浓度lps刺激选定时间后,混匀细胞悬液;收集细胞离心后离心、重悬、洗涤、重悬,避光下孵育,测试前5min加入pi染色,补加bindingbuffer重悬,样品置入流式细胞检测仪进行监测并记录;重复试验3次。1.2.8细胞atp含量测定所需试剂及仪器:试剂:promegacelltiter-glo萤光细胞活性检测试剂盒(buffer及底物冻干粉),bertholdlb962centrolia/pc细胞发光记录仪。底物冻干粉溶解获取检测试剂;选取处于对数生长期的所有受试者细胞系,在选定浓度lps刺激后,在刺激后0小时和选定时间点混匀细胞悬液,并测量细胞密度;加样并准备对照孔以测量背景发光值;加样完毕后置于光记录仪振荡后静置,测量测量荧光发光值并记录;重复试验3次。1.3统计学方法1.3.1该家系全部临床资料以epidata3.1数据管理软件(epidata,epidataassocitation)录入并建立数据库;1.3.2所有统计分析采用spss19.0统计软件(solutionsstatisticalpackageforthesocialsciences,ibm),所有组间定量资料以均值±标准差进行描述,留取小数点后2位,采用t检验或wilcoxon秩和检验进行分析,统计值留取小数点后3位;定性资料以例数和百分比进行描述,百分比数字留取小数点后两位,采用χ2检验进行分析,统计值留取小数点后三位。以p<0.05为标准,认为差异具有统计学意义。2结果2.1家系研究结果先证者所在家系为1个由3代成员组成的中国汉族家系,参与研究的家系成员为3代中7人,均为中国汉族,家系图如图1所示。2.2家系成员线粒体6459位点测序结果全部受试者线粒体基因测序结果如图2,该家系中母系遗传成员ⅰ-1、ⅱ-1、ⅱ-2、ⅱ-4均出现线粒体t6459c突变,将其作为突变组(除t6459c外,不存在其它的错义突变);非该母系遗传成员ⅱ-3、ⅲ-1、ⅲ-2均无该突变,将其作为非突变组。线粒体t6459c突变在该家系受试者中表现出母系遗传的特点。2.3基线水平结果全部7名受试者均于同日采取血标本进行血常规、血生化、凝血功能检查,检查结果如表1所示,突变组与非突变组各项检验指标组间差异均不存在统计学差异,可以认为全部受试者环境因素对疾病的影响差异小。表1突变组和非突变组实验室检查结果比较2.4细胞功能检测2.4.1活性氧水平测定该家系全部受试者的细胞系在无刺激及1×102ng/mllps刺激后6小时后上机测量,试剂中所含dcfh-da(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)作为对氧化敏感的荧光探针其本身没有荧光,可在进入细胞后被细胞内的活性氧氧化并发出荧光,同时氧化后的dcfh-da无法通过细胞膜而只能留在细胞内,通过检测荧光值即可判断细胞内活性氧水平,测试结果如表2和图3所示,突变组细胞在无刺激条件下活性氧水平显著高于无突变组((4210.42±1043.35vs.3387.78±489.66,p=0.028))。lps刺激6小时后,突变组活性氧水平显著升高(4210.42±1043.35vs.5759.25±2297.90,p=0.045),非突变组升高趋势不具备统计学意义(3387.78±489.66vs.3862.00±1519.77,p=0.386),突变组仍显著高于非突变组(5759.25±2297.90vs.3862.00±1519.77,p=0.045)。表2突变组与非突变组细胞活性氧水平突变组非突变组tp无刺激4210.42±1043.353387.78±489.662.4010.028*lps6h5759.25±2297.903862.00±1519.772.1430.045*t-2.126-0.891p0.045*0.3862.4.2线粒体膜电位测定该家系全部受试者的细胞系在无lps刺激及1×102ng/mllps刺激后6小时后上机测量,测试结果以ⅱ-2、ⅱ-3为例,如图4所示。jc-1是一种荧光探针,线粒体膜电位较高时在线粒体基质中聚合产生红色荧光;线粒体膜电位较低时jc-1无法聚合,以单体的形式产生绿色荧光。因此,两种荧光的比例可反映线粒体膜电位高低。通过阴性与阳性对照观察后,以绿色荧光细胞多聚区域设置为p2门,以红色荧光细胞多聚区域为p3门,进行测量,记录两门内细胞数量,以p2/p3的形式表达jc-1单体与多聚体比例,其值与线粒体膜电位成反比,重复试验3次后将突变组与非突变组结果进行比较,如表3所示。突变组在无刺激条件下,线粒体膜电位显著低于非突变组(0.77±0.57vs.0.38±0.14,p=0.047)。lps刺激6小时后,突变组mmp下降,非突变组mmp升高,突变组仍显著低于非突变组(0.81±0.52vs.0.29±0.86,p=0.005),见图5。表3细胞系细胞线粒体膜电位突变组非突变组tp无刺激0.77±0.570.38±0.142.1970.047*lps6h0.81±0.520.29±0.863.4120.005*t0.180-0.310p0.8590.7612.4.3细胞凋亡状态测定该家系全部受试者的细胞系无刺激及1×102ng/mllps刺激6小时后上机测量细胞凋亡情况(10-12),测试结果以ⅱ-2、ⅱ-3为例,如图6所示。细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸会从细胞膜内侧翻转至细胞膜表面。试剂中的annexin-v是一种依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸可以高亲和力结合。同时试剂中所含碘化丙啶(propidiumiodide,pi)作为一种核酸染料,被正常细胞及早期凋亡细胞的完整细胞壁所阻隔,但凋亡晚期及坏死细胞的细胞膜无法阻隔,进而使细胞核染色。将annexinv值设定为横坐标,将pi值设定为纵坐标,通过阳性对照与阴性对照设定设定参考基线。基线左下为活细胞(annexinv-,pi-),参考线右上为晚期凋亡细胞或坏死细胞(annexinv+,pi+),而参考线右下为早期凋亡细胞(annexinv+,pi-),记录各区细胞数量。将各细胞系所得结果中早期凋亡细胞所占百分比记录,重复试验3次后将突变组与非突变组进行对比,(54.17±22.76vs.29.24±10.87,p=0.004)如表4所示,突变组在无刺激条件下凋亡比例显著高于非突变组。lps刺激6小时,突变组凋亡比例有所增加,非突变组凋亡比例有所下降,两组变化趋势均不显著,但突变组凋亡比例仍显著高于非突变组,(56.32±19.39vs.28.73±15.94,p=0.003),如图7所示。表4突变组与非突变组细胞凋亡情况突变组非突变组tp无刺激54.17±22.7629.24±10.873.3230.004*lps6h56.32±19.3928.73±15.943.4730.003*t-0.2490.079p0.8060.9382.4.4细胞atp含量测定该家系全部受试者的细胞系无刺激条件和1×102ng/mllps刺激6小时后上机测量,因试剂中所含荧光素酶可利用细胞内atp催化荧光素氧化并发出光子,测定发光量可判断细胞内atp含量,以此反映线粒体产atp水平的功能,测试结果如表5所示。无刺激条件下,突变组细胞atp含量显著均值低于非突变组(620.37±293.09vs.1304.47±1083.55,p=0.049)。lps刺激6小时后,突变组细胞atp含量下降,非突变组细胞atp含量升高,两组变化趋势均不显著,但非突变组刺激后的atp含量显著高于突变组,如图8所示。表5突变组与非突变组细胞atp含量突变组非突变组tp无刺激620.37±293.091304.47±1083.55-2.1030.049*lps6h552.93±271.071625.28±962.61-3.2470.010*t0.585-0.664p0.5640.516以上所纳入的一个三代7人的中国汉族家系,该家系成员体重性别及生化等血液检测未发现统计学差异(p>0.05),而且突变组与非突变组生活环境及生活习惯相似,环境因素对脓毒症的发病率影响较小。此外,观察到突变组细胞功能进一步下降,atp含量和线粒体膜电位下降,活性氧水平和细胞凋亡比例升高,提示mtdnat6459c突变的细胞对于lps刺激早期可产生明显的脓毒症样病理改变,并出现了线粒体的损伤。突变组在引入lps刺激后,以活性氧水平变化趋势最显著,推测在脓毒症早期病理改变中线粒体和细胞功能的损伤以活性氧的影响为主。非突变组在lps刺激后,仅活性氧出现不显著的升高,细胞atp含量、膜电位均略有升高,凋亡比例略有下降,且各项细胞功能指标较非突变组仍存在显著的差异,提示不含mtdnat6459c突变的细胞对于lps刺激不产生明显的脓毒症样病理改变。因此,mtdnat6459c突变可能导致cox结构功能发生变化致使活性氧增加,造成线粒体功能障碍,细胞凋亡,增加脓毒症的遗传易感性;mtdnat6459c突变使脓毒症早期就出现线粒体损伤,并产生脓毒症明显的病理改变。也即,通过分析线粒体mt-co1基因第6459位碱基t到c突变能够辅助早期脓毒症诊断和筛查。此外,mt-co1基因在进化中保守性较高,且所发现t6459c突变为非同义突变,三联碱基由uga突变为cga,mt-co1多肽链中色氨酸突变为精氨酸。因此,通过分析线粒体mt-co1多肽链第186位氨基酸是否突变也可实现本发明的目的。以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。当前第1页12
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