ALDH2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:11172068阅读:1477来源:国知局
ALDH2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域,具体涉及一种aldh2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。



背景技术:

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)是指dna序列中单个碱基的差别,碱基对由于排列方式不同,结合不同的脱氧核酸形成核苷酸对,这些核苷酸对构成密码子,密码子则以不同的排列顺序编码蛋白质,从而形成自然界多种多样的生命。在基因组dna中,任何碱基均有可能发生变异,因此snp既有可能在基因序列内,也有可能在基因以外的非编码序列上。

snp与许多疾病相关,决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此,snp在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价值。

乙醛脱氢酶2(aldehydedehydrogenase2,aldh2)是酒精代谢的关键酶,它能催化乙醇代谢的有毒、致癌的乙醛脱氢转变为无毒的乙酸。此外,aldh2还兼具硝酸酯酶活性,是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键。

aldh2基因的主要多态性位点是rs671(g>a),正常的等位基因记为aldh2*1,单碱基突变的等位基因记为aldh2*2。研究发现,aldh2*1/aldh2*1基因型(野生型)具有aldh2的正常活力,aldh2*1/aldh2*2基因型(杂合型)存在6%的酶活力,而aldh2*2/aldh2*2基因型(突变型)则完全丧失酶的活力,使硝酸甘油无法产生一氧化氮,难以发挥药效。aldh2位点的多态性为先天遗传,与任何疾病的发生无关,与年龄无关。

综上所述,aldh2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据,具有重要的临床应用意义。

目前,检测aldh2基因rs671位点基因型的方法有pcr-pflp、sanger双脱氧链终止法测序、荧光定量pcr、焦磷酸测序、基因芯片等,除pcr-rflp法外,其他方法均需昂贵设备,操作相对繁琐,检测周期长,检测成本高,部分方法还存在结果不稳定、重复性差等缺点。相反,pcr-rflp法操作简单,对仪器设备要求低,但该受内切酶的活性、酶切时间、酶切体系等影响很大,可能造成酶切不全导致基因型误判。此外,以上方法均需要提取样本dna,从抽血到提纯dna至少需要4个小时,到最终得到检测结果至少需要8小时,且对仪器设备要求高、检测环境要求严格。因此,难以满足临床上对疾病简便、快速、准确诊断的要求。

为解决以上问题,需建立一种简便、快速、准确鉴别aldh2基因型的方法,组装成可满足临床诊断需求的aldh2基因型鉴别诊断试剂盒。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速省时且特异性高、灵敏度好的分型检测方法,的aldh2基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:aldh2基因多态性快速检测的试剂盒,包括pcr反应混合液;pcr反应混合液的原料及终浓度为,

dna聚合酶0.05-0.09u/μl;

dntps0.2mm;

5xpcr缓冲液1.1x;

mgcl21.5-2.5mm;

十二烷基硫酸钠0.0005-0.015%(w/v);

聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03%(w/v);

上游引物0.4-0.5μm;

下游引物0.4-0.5μm;

突变型分子信标0.4-0.5μm;

野生型分子信标0.3-0.4μm;

其用于检测细胞样品。

采用本发明技术方案的aldh2基因多态性快速检测的试剂盒,本发明采用的是一种mg2+依赖性dna聚合酶,以dna为复制模板,将dna由5'端开始复制到3'端。dntp是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写,dntps则是由四种脱氧核苷酸(datp、dgtp、dttp、dctp)以相同的比例混合而成,是dna复制的原料。上游引物、下游引物作为dna复制的起始点,在dna合成中dna聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的dna链上,因此,在核酸合成反应中,引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。mgcl2的作用是提供mg2+,与dntp以及dna模板结合形成复合体,只有这种复合体才能被dna聚合酶识别。pcr缓冲液的作用是有助于酶的稳定,给dna聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。细胞裂解液(由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成)的作用是溶解细胞质和细胞膜,溶解之后产生的杂质对pcr反应的影破坏分子间许多微弱的化学键,分解一些蛋白酶,降低细胞裂响。

在现有的pcr反应中,以细胞直接作为模板的pcr反应,通常无法彻底裂解细胞,并且裂解后的细胞碎片及一些细胞内容物(如蛋白酶)对pcr反应有抑制,最终导致分型结果不稳定,甚至失败。

本发明的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂,十二烷基硫酸钠是一种能够使蛋白质变性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域,十二烷基硫酸钠(简称sds)经常被用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物,在较高温度下,破坏蛋白质与dna的结合,使dna释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚(简称tritonx-100)被用于分解蛋白酶,聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还作为限制性内切酶的缓冲液的成分之一。实验过程中,发明人发现通过sds和tritonx-100混合组成,配合与基因相关的原料终浓度,在增强细胞裂解程度的同时还降低了这些潜在的抑制剂对pcr的抑制作用(通过溶解细胞质和细胞膜,破坏分子间微弱的化学键,分解一些蛋白酶)可快速解决污染样品的问题。减少了dna提取过程,且避免污染样品,从而节约时间,整个检测过程仅需要1h,进而为临床的快速诊断带来依据,实现精准用药。

本发明与现有技术相比,本发明具有操作简便、耗时短、无需专业人员、检测结果准确、结果判读简单、无创取样等优点,适合基层临床检测,对检测环境要求低、可以实现对aldh2的快速、高效且准确的分型检测,为硝酸甘油治疗心绞痛的及时治疗、饮酒指导、相关癌症的发生等提供参考,解决了现有方法有创采血、检测周期长、检测成本高及需专业检测人员等缺点。

由实验可知,pcr反应混合液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果均正确。其中,5x反应缓冲液1x的原料为5x反应缓冲液,指的是初始浓度为5倍的反应缓冲液,1x是指的应用的终浓度。

进一步,所述的pcr反应混合液的原料终浓度为:

dna聚合酶0.09u/μl;

dntps0.2mm;

5xpcr缓冲液1.1x;

mgcl22.5mm;

十二烷基硫酸钠0.005%w/v;

聚乙二醇辛基苯基醚0.01%w/v;

上游引物0.4μm;

下游引物0.4μm;

突变型分子信标0.4μm;

野生型分子信标0.3μm。

由实验可知,pcr反应混合液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果最准确,且成功率最高。

进一步,所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。本发明以直接刮取的口腔黏膜脱落细胞为样本,操作方便。

进一步,还包括有提纯的人类基因组dna基因序列。试剂盒中包括质控品,为提纯的人类基因组dna基因序列,是在测定时为了做平行试验,来测定试剂结果的有效性。

本申请还提出另一个技术方案,本发明试剂盒中的aldh2基因多态性快速检测的引物,

上游引物5’-3’的基因序列为:acagggtcaactgctatgat;

下游引物5’-3’的基因序列为:agcaggtcccacactca。

本申请还提出另一个技术方案,试剂盒中引物检测的aldh2基因多态性快速检测的分子信标,野生型分子信标的5’-3’的基因序列为:aggcatacac+t+gaagt;

突变型分子信标的5’-3’的基因序列为:caggcatacac+t+aaagt;

且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团或非荧光淬灭基团;

+为锁核酸修饰的碱基。

进一步,所述的野生型分子信标的荧光基团为fam标记基团,淬灭基团为非荧光淬灭基团,并进行mgb修饰;突变型分子信标荧光基团为texasred标记基团,淬灭基团为非荧光淬灭基团,并进行mgb修饰。本发明中所使用的荧光基团和非荧光淬灭基团,当然,也可用其他荧光基团和与其配合的淬灭基团代替,不影响检测结果。

本技术方案使用的分子信标是taqman-mgb探针,是一种寡核苷酸探针,taqman-mgb探针采用非荧光淬灭基团,并对探针进行mgb修饰,可在较短的碱基数量下达到较高的tm值,增强杂交特异性。taqman-mgb探针用于snp检测是利用两条由不同荧光基团标记,且可与这些位点不同碱基互补的taqman-mgb探针与扩增片段进行特异性杂交。杂交过程中taqdna聚合酶运用5’-3’核酸外切酶活性将探针酶切降解,致使荧光基团与淬灭基团分离从而释放荧光信号。随着扩增片段数量的积累,荧光信号也得到相应的增加并被仪器采集。通过配套软件对采集的荧光信号进行分析,即可获得所检测样本的基因型。根据aldh2基因rs671多态性位点及周边序列,分别设计野生型分子信标和突变型分子信标,分子信标要求在适宜的退火温度下,野生型分子信标可与未突变序列结合,不与突变序列结合;且突变型分子信标可与突变序列结合,而不与未突变序列结合。

检测的原理为:在aldh2基因突变位点(rs671)两侧保守区域设计一对引物,并在突变位点序列处分别设计两个taqman-mgb分子信标:aldh2突变型分子信标和aldh2野生型分子信标。aldh2野生型分子信标与未突变序列结合,aldh2突变型分子信标与突变位点序列结合。野生型分子信标、突变型分子信标5′端均用荧光素标记,3′端均用淬灭基团标记。在适宜的pcr退火温度下,野生型分子信标与未突变的序列结合,不与突变序列结合;而突变型分子信标与有突变位点的序列结合,不与未突变的序列结合。在分子信标与靶序列结合后,随着扩增的进行,探针可被dna聚合酶运用5’-3’核酸外切酶活性将探针酶切降解,致使荧光基团与淬灭基团分离从而释放荧光信号。本发明中,利用绿色荧光基团标记野生型分子信标,利用红色荧光基团标记突变型分子信标,从而可通过荧光的颜色来判断所检测基因的基因型。

本申请还提出另一个技术方案,利用上述的引物、分子信标及试剂盒进行的aldh2基因多态性快速检测方法,操作方法为:

(1)取样前用水漱口2次,每次大于5秒,漱口后吞咽2-3次;

(2)取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁,均匀刮拭5次,上、下为1次;

(3)取样后将取样装置的取样部插入pcr反应混合液中,混匀;

(4)取1μl提纯的人类基因组dna基因序列加入到另一支pcr反应混合液中,混匀;

(5)将完成加样的pcr反应液放入荧光pcr仪中,运行反应程序。

进一步,荧光pcr仪的反应程序为:

a、预变性:温度95℃,5min,1个循环;

b、变性:95℃,8s;

c、退火及延伸:56℃,35s;

d、b及c程序操作50个循环。

进一步,所述的荧光pcr仪为双通道,激发波长分别为450-500nm和550-600nm。

附图说明

图1是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图;

图2是本发明实施例一的第二个样品检测扩增曲线图;

图3是本发明实施例一的第三个样品检测扩增曲线图;

图4是本发明实施例二的第一个样品检测扩增曲线图;

图5是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图;

图6是本发明实施例二的第三个样品检测扩增曲线图;

图7是本发明实施例三的第一个样品检测扩增曲线图;

图8是本发明实施例三的第二个样品检测扩增曲线图;

图9是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图;

图10是本发明实施例四的第一个样品检测扩增曲线图;

图11是本发明实施例四的第二个样品检测扩增曲线图;

图12是本发明实施例四的第三个样品检测扩增曲线图;

图13是本发明实施例五的刮取3次的第一个样品检测扩增曲线图;

图14是本发明实施例五的刮取3次的第二个样品检测扩增曲线图;

图15是本发明实施例五的刮取3次的第三个样品检测扩增曲线图;

图16是本发明实施例五的刮取5次的第一个样品检测扩增曲线图;

图17是本发明实施例五的刮取5次的第二个样品检测扩增曲线图;

图18是本发明实施例五的刮取5次的第三个样品检测扩增曲线图;

图19是本发明实施例五的刮取7次的第一个样品检测扩增曲线图;

图20是本发明实施例五的刮取7次的第二个样品检测扩增曲线图;

图21是本发明实施例五的刮取7次的第三个样品检测扩增曲线图。

图22是本发明质控品-提纯的人类基因组dna基因序列的检测扩增曲线图。

具体实施方式

以下是本发明aldh2基因多态性快速检测试剂盒中的各实施例的原料终浓度,如表1所示:

表1

以下为本发明aldh2基因多态性快速检测的具体操作方式:

一、细胞裂解液的配制

配置1000ul的细胞裂解液试剂,十二烷基硫酸钠(sds)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)购自上海普洛麦格生物制品有限公司,初始浓度分别为0.1g/ml、1.0655g/ml。

细胞裂解液配方均为在pcr反应体系中的最终浓度,由于此浓度非常小,配制少量此浓度的裂解液加样时误差会增大,所以为了配制的裂解液的浓度准确,采用对上述四个配方中的十二烷基硫酸钠(sds)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)的浓度扩大,在加样时,将其扩大的浓度加一定体积量,使其满足上述终浓度的要求,如果定义上述四个配方中的最终浓度为1倍(1×),则将浓度扩大为200倍(200×),细胞裂解液在加入pcr反应体系时稀释200倍,使其终浓度为1倍即可,200×的细胞裂解液在配制好后震荡混匀,-4℃保存。

不同终浓度的细胞裂解液均配制成为200×的储存液,因为每一支反应液所需原料少,加之聚乙二醇辛基苯基醚为粘稠液体,不易精准吸取。

所有试剂配制均在灭菌后的超净工作台进行。

(1)实施例一中200x细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管,加入10μl十二烷基硫酸钠和1.88μl聚乙二醇辛基苯基醚,再加入988.12μl无核酸酶的水至总体积1000μl,使十二烷基硫酸钠的终浓度达到0.1%,使聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度达到0.2%,即为200×的细胞裂解液,然后震荡混匀,-4℃保存。

(2)实施例二和实施例五中200x细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管,加入100μl十二烷基硫酸钠和18.78μl聚乙二醇辛基苯基醚,再加入881.22μl无核酸酶的水至总体积1000μl,使十二烷基硫酸钠的终浓度达到1%,使聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度达到2%,即为200x的细胞裂解液,然后震荡混匀,-4℃保存。

(2)实施例三中200x细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管,加入200ul十二烷基硫酸钠(sds)和37.56ul聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100),再加入762.44ul无核酸酶的水至总体积1000ul,使sds的终浓度达到2%,使tritonx-100的终浓度达到4%,即为200x的细胞裂解液,然后震荡混匀,-4℃保存。细胞裂解液在加入pcr反应体系时稀释200倍,使其终浓度为1倍。

(3)实施例四中200x细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管,加入300ul十二烷基硫酸钠(sds)和56.34ul聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100),再加入643.66ul无核酸酶的水至总体积1000ul,使sds的终浓度达到3%,使tritonx-100的终浓度达到6%,即为200x的细胞裂解液,然后震荡混匀,-4℃保存。细胞裂解液在加入pcr反应体系时稀释200倍,使其终浓度为1倍。

上游引物5’-3’的基因序列为:acagggtcaactgctatgat;

下游引物5’-3’的基因序列为:agcaggtcccacactca。

野生型分子信标5’-3’的基因序列为:

fam标记-aggcatacac+t+gaagt-mgb修饰;

突变型分子信标5’-3’的基因序列为:

texasred标记-caggcatacac+t+aaagt-mgb修饰。

上述原料,除上游引物、下游引物、细胞裂解液外,均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。上游引物和下游引物均由上海基康生物技术有限公司合成。野生型分子信标和突变型分子信标均由上海占标生物科技有限公司合成。

二.pcr反应混合液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在灭菌后的超净工作台的冰盒上进行,保证低温且无污染。

表2

三、aldh2基因型检测

aldh2基因型快速检测试剂盒由9支分装好的试剂管组成,每个被测者检测3次重复(一次一支反应液),每测试9支试剂,同时测试一次质控品,质控品即为提纯的人类dna样品,作为平行测试。该质控品为aldh2突变杂合型,当结果如图22所示时,表明试剂能有效地进行分型,表示其他试剂测试结果同样可信。

将配制好的pcr反应混合液分装于试剂管中,实施例一、二、三、四、五每支分装23.5μl,-20℃避光保存;

(1)取样前用清水漱口2次,每次不少于5秒,漱口后吞咽2-3次,尽量避免口腔内壁残留唾液;

(2)取出一次性使用无菌拭子(专利授权公告号:cn205359515u)及反应液,拔掉反应液塞子及拭子端盖;

(3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁,实施例一、二、三、四均匀刮拭5次(上下为1次),实施例五分别均匀刮拭3、5、7次(上下为1次),力度以腮部微突为宜;

(4)取样后立即将拭子插入反应液中,按压使其与试剂管密封,避光暂存;

(5)按压顶部使其与试剂管密封,而后轻弹试剂管使样本与反应液充分混匀;

(6)用移液器取1μl质控品加入到一支反应液中,轻弹试剂管并混匀;

(7)将完成加样的反应液放入om-1000型荧光pcr仪器(专利授权公告号:cn103820306b)中,并运行表3中程序。

在20s内连续完成步骤(2)~(4)。

表3

(7)得到扩增曲线和荧光颜色,分析结果。

四、结果分析

因为人类基因组为二倍体,每一基因座位上含有两个等位基因。因此结果共有三种,分别是“gg”、“ga”或“aa”,其中阴性结果是“gg”,阳性结果是“ga”和“aa”。图中g线表示aldh2未突变基因扩增情况,a线表示aldh2突变基因扩增情况。

实施例一的检测结果为:

由图1可知:只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图2可知:只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图3可知:g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

实施例二的检测结果为:

由图4可知:只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图5可知:只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图6可知:g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

实施例三的检测结果为:

由图7可知:只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图8可知:只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图9可知:只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,表示检测结果是突变型,检测结果错误。

实施例四的检测结果为:

由图10可知:只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图11可知:只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图12可知:g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

实施例五检测结果为:

由图13可知:取样3次时,只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图14可知:取样3次时,只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图15可知:取样3次时,g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

由图16可知:取样5次时,只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图17可知:取样5次时,只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图18可知:取样5次时,g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

由图19可知:取样7次时,只有g线有指数增长,而a线没有指数增长,因此检测结果是野生型gg,检测结果正确;

由图20可知:取样7次时,只有a线有指数增长,而g线没有指数增长,表示检测结果是纯合变异型aa,检测结果正确;

由图21可知:取样7次时,g线和a线都有指数增长,表示检测结果是杂合变异型ga,检测结果正确;

综合实施例一、实施例二、实施例四和实施例五分型结果均正确,实施例三分型结果错误。说明本发明的各原料终浓度的均可检测正确,超出本发明原料的终浓度检测不准确。综合应该强度、ct值及曲线拟合情况,最终选择实施例二组合为最佳原料配比。实施例五的分型结果均正确,说明刮取次数对检测结果无影响。

核苷酸序列表如下:

<110>重庆京因生物科技有限责任公司

<120>aldh2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

acagggtcaactgctatgat

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

agcaggtcccacactca

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

aggcatacac+t+gaagt

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

caggcatacac+t+aaagt。

对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明技术方案的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

<110>重庆京因生物科技有限责任公司

<120>aldh2基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

acagggtcaactgctatgat

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

agcaggtcccacactca

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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<221>misc_binding

<400>3

aggcatacac+t+gaagt

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

caggcatacac+t+aaagt。

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